葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤大鼠海马7种单胺类神经递质及代谢产物含量水平的影响△

王旭，陈绍红，钟赣生*，柳海艳，王茜，刘明，赵桐，于雪，范盎然，张傲哲

(1.北京中医药大学 基础医学院，北京 100029；2.河北中医学院，河北 石家庄 050200)

葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤大鼠海马7种单胺类神经递质及代谢产物含量水平的影响△

王旭1，陈绍红1，钟赣生1*，柳海艳1，王茜2，刘明1，赵桐1，于雪1，范盎然1，张傲哲1

(1.北京中医药大学 基础医学院，北京 100029；2.河北中医学院，河北 石家庄 050200)

目的：从配伍剂量、给药周期两个角度，探讨葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤大鼠海马7种单胺类神经递质及代谢产物含量的影响。方法：采用白酒灌胃的方法复制慢性酒精性肝损伤大鼠模型，将Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、东宝甘泰组、葛花枳椇子配伍组(低、中、高剂量)，分别于灌胃4、8、12周后，冰上快速剥取海马组织，利用高效液相-电化学方法检测大鼠海马单胺类神经递质及其代谢产物的含量。结果：造模4周后，与模型组相比，5-羟色胺(5-HT)的含量在配伍的3个剂量组有统计学差异；去甲肾上腺素(NE)的含量在配伍中、高剂量组有统计学差异；高香草酸和肾上腺素的含量在配伍中剂量组有统计学差异。造模8周后，与模型组相比，5-HT的含量在配伍的3个剂量组有统计学差异；5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的含量在配伍中、高剂量组有统计学差异；多巴胺的含量在配伍中剂量组有统计学差异。造模12周后，与模型组相比，5-HIAA的含量在配伍低、高剂量组有统计学差异；NE的含量在配伍中剂量组有统计学差异。结论：葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤模型大鼠海马单胺类神经递质及代谢产物含量有一定的调节作用，为葛花、枳椇子配伍防治酒精性相关疾病的研究提供了数据支撑。

葛花；枳椇子；配伍；单胺类神经递质；慢性酒精性肝损伤

葛花和枳椇子在古代即是解酒的常用中药，明代《滇南本草》中记载葛花：“治头晕，憎寒壮热。解酒醒脾，治酒毒酒痢，饮食不思，胸膈饱胀发呃，呕吐酸痰，酒毒伤胃，吐血呕血。消热，解酒毒[1]。”清代《本经逢原》中记载枳椇“木能败酒，屋外有此木，屋内酿酒皆不佳，丹溪治酒病，往往用其实[2]。”课题组前期对急性酒精中毒动物模型的研究，明确了葛花和枳椇子的解酒保肝作用[3-4]。之后又进行了葛花、枳椇子不同比例配伍对慢性酒精性肝损伤大鼠模型的研究，结果表明葛花、枳椇子以2∶1比例配伍时在肝损伤方面有更好的防治作用[5]。本实验主要是在慢性酒精性肝损伤大鼠模型的基础上，从配伍剂量、给药周期两个角度探讨葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤模型大鼠海马单胺类神经递质及代谢产物的量-时-效关系，因有研究报道，长期酒精摄入可对中枢神经系统产生损伤，其机制可能是酒精影响中枢某些神经递质的含量及其受体的活性，因此本文同时观察了葛花、枳椇子以2∶1比例配伍后对大鼠海马单胺类神经递质含量水平的影响，以期为葛花、枳椇子防治酒精性相关疾病的研究提供依据。

1 材料

1.1 动物

雄性Wistar大鼠，体重180～200 g(北京维通利华实验动物技术有限公司)，许可证编号：SCXK(京)2012-0001。

1.2 药物

葛花为豆科植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的花，枳椇子为鼠李科植物枳椇HoveniaacerbaLindl.干燥成熟带肉质果柄的果实或种子，购自北京本草方源药业有限公司，批号分别为20120722、20120729。东宝肝泰片(通化东宝药业股份有限公司，批号：121109)。

葛花、枳椇子药液制备：将葛花、枳椇子按2∶1的比例混合浸泡0.5 h，第一次加10倍量水煎煮提取1.5 h，第二次加8倍量水煎煮提取1 h。滤过，合并滤液，浓缩至一定浓度。使用时，加0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)配制成所需浓度的药液，给药体积为10 mL·kg-1。东宝肝泰药液配制：使用时用0.5% CMC配成0.036 g·mL-1浓度的药液，给药体积为10 mL·kg-1。

1.3 试剂

56°红星二锅头酒(北京红星酿酒股份有限公司)。

单胺类神经递质对照品：5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺(DA)、3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)，均购自美国Sigma公司。

内标：3，4-二羟苄胺(DHBA，美国Sigma公司)。

色谱级甲醇(fisher)、L-半胱氨酸(amresco)、磷酸二氢钠(merck)、辛烷磺酸钠(Alfa)、乙二胺四乙酸二钠(Alfa)、氯化钾(Alfa)均为进口分析纯。

1.4 仪器

Agilent 1100LC型高效液相色谱仪(美国Agilent)，包括G1379A型脱气机、G1311A型色谱泵、G1313A型自动进样器、G1316A型柱温箱；DECADEⅡSDC型电化学检测器(荷兰ANTEC公司)，包括玻璃碳工作电极、Ag/AgCl参比电极、工作站(Clarity CHS)；Biofuge Stratos高速冷冻离心机(德国HERAEUS)；VCX130型超声破碎仪(美国SONICS)。

2 方法

2.1 模型复制

大鼠正常喂养一周后开始造模，用56°红星二锅头酒灌胃，第1周每天给酒8 mL·kg-1，1次灌胃，连续2周；第3周每天给酒10 mL·kg-1，以后每周称重，根据体重计算给酒量，分别连续4、8、12周。以肝功能指标及病理形态学检验慢性酒精性肝损伤模型是否复制成功。

2.2 实验分组及给药方法

Wistar大鼠随机分成6组：空白组、模型组、东宝肝泰组、配伍低剂量组(生药3 g·kg-1)、配伍中剂量组(生药6 g·kg-1)、配伍高剂量组(生药12 g·kg-1)。空白组给予0.5% CMC灌胃，灌胃体积为10 mL·kg-1，其余各组给予白酒灌胃(给酒方法见模型复制)，配伍各剂量组每日上午先给予相应浓度的药液，给药体积为10 mL·kg-1，下午给予白酒灌胃(给酒方法同2.1)。

2.3 样本处理

分别于实验第4、8、12周，末次给药后，于晚10点禁食12 h，次日灌酒1 h后，将动物快速断头，取脑，置于冰上剥离所要组织部位。称重加入组织裂解液(0.2 mol·L-1高氯酸，0.01%L-半胱氨酸，0.5 mmol·L-1EDTA二钠)，每10 mg组织加入50 μL裂解液，冰浴超声破碎10 s。离心30 min、4 ℃、15 000 r·min-1，取上清液-80℃冻存以析出蛋白，检测前再以15 000 r·min-1离心30 min，取上清液用0.22 μm耐酸过滤器过滤，取20 μL检测。待检海马单胺类神经递质NE、E、DA、5-HT，及代谢产物DOPAC、HVA、5-HIAA。各神经递质含量以ng·g-1脑组织湿重表示。

2.4 检测条件

2.4.1 色谱条件 固定相：Skyam®C18柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)；流动相：磷酸二氢钠100 mmol·L-1，辛烷磺酸钠0.74 mmol·L-1，乙二胺四乙酸钠0.027 mmol·L-1，氯化钾8 mmol·L-1，甲醇8%，pH值为3；流速：0.2 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；测定电极电势：500 mV。各对照品及大鼠海马组织的分离图谱见图1、图2。

注：1.NE；2.E；3.DHBA；4.DOPAC；5.DA；6.5-HIAA；7.HVA；8.5-HT；下同。图1 各对照品分离图谱

图2 大鼠海马组织的分离图谱

2.4.2 标准曲线 以峰面积为纵坐标(Y)，NE、E、DA、5-HT、DOPAC、HVA、5-HIAA的质量浓度为横坐标(mg·L-1)，绘制标准曲线。NE在0.011 8～1.516 0 mg·L-1线性良好，回归方程为Y=863.01X；E在0.015 3～1.960 0 mg·L-1线性良好，回归方程为Y=689.96X；DOPAC在0.000 6～0.160 0 mg·L-1线性良好，回归方程为Y=775.96X；DA在0.002 5～0.637 5 mg·L-1线性良好，回归方程为Y=300.61X；5-HIAA在0.000 7～0.176 4 mg·L-1线性良好，回归方程为Y=1 099.03X；HVA在0.048 8～1.560 0 mg·L-1线性良好，回归方程为Y=59.31X；5-HT在0.010 8～0.345 0 mg·L-1线性良好，回归方程为Y=690.98X，r=0.999 9。

2.5 统计方法

3 结果

3.1 造模4周后葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤大鼠海马单胺类神经递质含量的影响

由表1可知，对于5-HT的含量变化，配伍的3个剂量组与模型组相比均有统计学差异；对于HVA的含量变化，配伍中剂量组与模型组相比有统计学差异；对于NE的含量变化，配伍中、高剂量组与模型组相比有统计学差异；对于E的含量变化，配伍中剂量组与模型组相比有统计学差异。

3.2 造模8周后葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤大鼠海马单胺类神经递质含量的影响

由表2可知，对于5-HT的含量变化，模型组与空白组相比有统计学差异，配伍的3个剂量组与模型组相比有统计学差异；对于5-HIAA的含量变化，模型组与空白组相比有统计学差异，配伍中、高剂量组和东宝肝泰组与模型组相比有统计学差异；对于DA的含量变化，配伍中剂量组与模型组相比有统计学差异；对于E的含量变化，东宝肝泰组与模型组相比有统计学差异。

3.3 造模12周后葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤大鼠海马单胺类神经递质含量的影响

由表3可知，对于5-HIAA的含量变化，配伍低、高剂量组与模型组相比有统计学差异；对于NE的含量变化，配伍中剂量组与模型组相比有统计学差异。

表1 造模4周后葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤大鼠海马单胺类神经递质含量的影响 /ng·g-1

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；下同。

表2 造模8周后葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤大鼠海马单胺类神经递质含量的影响 /ng·g-1

表3 造模12周后葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤大鼠海马单胺类神经递质含量的影响 /ng·g-1

4 讨论

现代社会酒精滥用情况日渐严重，酒精属亲脂性小分子化学物质，饮酒后，酒精能迅速进入血液循环而分布全身，对神经系统和肝脏的损害最为严重。在临床，酒精所致精神障碍合并酒精性肝损伤已是最常见的病种之一。

单胺类神经递质包括儿茶酚胺(CA)和5-HT两大类，CA又包括DA、NE和E。DA分解产生DOPAC和HVA，5-HT分解产生5-HIAA[6]。有研究显示，长期或大量饮酒者的CT扫描显示一定程度的脑萎缩[7]，酒精的摄入可以影响神经传递物质(如多巴胺、去甲肾上腺素、γ-氨基丁酸、血清素等)的代谢，从而导致挑衅行为和暴力事件的发生[8]。海马的功能意义主要是学习记忆方面，海马结构中已被确认的神经递质不下十几种，其中分布较广泛、研究较多的是单胺类神经递质。海马中单胺类神经递质含量的变化可能是酒精致学习记忆障碍和精神障碍的机制之一。

5-HT属吲哚胺类递质，与情感障碍密切相关，5-HIAA是其代谢产物。杨牧祥等[9]研究显示，酒精中毒小鼠脑中5-HT含量较正常组显著升高。本研究结果与上述研究一致，采用56°酒精灌胃造模4周后，模型组大鼠海马中5-HT含量较空白组就有升高趋势，8周后就有显著升高，说明酒精可干扰5-HT的代谢。5-HT进入胞浆后，被线粒体表面的单胺氧化酶(MAO)氧化脱氨，首先生成5-羟吲哚乙醛，然后被醛脱氢酶作用生成5-HIAA，这是5-HT代谢最主要的途径[6]。有研究显示，乙醇的初级代谢产物乙醛可抑制醛脱氢酶(ALDH)的活性[10]，另有研究发现酒精暴露可显著抑制胎鼠脑中MAO的活性[11]，这两种酶活性的抑制都可致5-HT含量升高。按照上述分析，酶活性的抑制应该导致代谢产物5-HIAA含量的降低，而本实验的结果却显示，造模8周后模型组大鼠海马中5-HIAA含量较空白组显著升高，造模12周后仍有升高趋势。毛健等[11]研究也显示，经过4.0 g·kg-1酒精处理后，胎鼠全脑中5-HIAA含量显著降低，也与本实验的结果不一致。因5-HIAA是5-HT无活性的代谢终产物，最终会随尿液排出体外，目前对其进行的研究较少，但5-HIAA的含量变化能够在一定程度上反映5-HT的代谢情况。

DA属儿茶酚胺类递质，与精神活动密切相关，DOPAC、HVA是其代谢产物。酒精可直接作用神经元细胞膜上的多巴胺D2受体，对多巴胺系统有兴奋作用，引起DA能神经元释放DA增多[12]。项翠琴等[13]研究也显示，乙醇可使大鼠脑中DA含量升高，且呈剂量效应关系，乙醇低剂量组(25.6%)的DA和DOPAC含量均显著升高。本研究采用56°酒精灌胃造模后，除造模4周末的HVA含量外，其余模型组大鼠海马中DA、DOPAC和HVA含量较空白组均有升高趋势，但差异无统计学意义。分析原因有以下可能，一是酒精对神经元尚未造成明显的病理损伤；二是DA有负反馈调节，为保持脑内DA能神经回路内环境的恒定，抑制DA的合成；三是酒精对DA能系统的影响不是单一的，可能对DA的合成、释放和灭活等多方面有影响。在本实验中，我们认为第三种可能性比较大，在酒精的作用下，中枢中DA的代谢情况可能较复杂。

NE和E属儿茶酚胺类递质，DA经多巴胺β羟化酶(DβH)作用生成NE，NE在苯乙醇胺-N-甲基转移酶(PNMT)作用下甲基化合成E[6]。去甲肾上腺素能神经元(NEn)主要位于脑桥和延髓，其中蓝斑核占NEn总数的一半[6]。有研究表明，酒精中毒者蓝斑核中去甲肾上腺素能神经元数目减少，密度下降，脑脊液中NE的浓度下降[14]，按照以上分析，NE浓度的下降会导致E浓度的下降。本研究采用56°酒精灌胃造模4、8、12周后，模型组大鼠海马中NE的含量较空白组有降低趋势，但差异无统计学意义。分析原因有以下可能，一是酒精对神经元尚未造成明显的病理损伤；二是因为NE、E的合成和代谢过程受到MAO、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)、DβH、ALDH和PNMT等众多酶的影响，其过程较复杂，还需要进一步的实验研究。

本研究还发现，造模4周后，与模型组相比，葛花、枳椇子配伍低剂量组的5-HT，配伍中剂量组的5-HT、HVA、NE和E，配伍高剂量组的5-HT、NE的含量变化有统计学差异；造模8周后，与模型组相比，葛花、枳椇子配伍低剂量组的5-HT，配伍中剂量组的5-HT、5-HIAA和DA，配伍高剂量组的5-HT、5-HIAA的含量变化有统计学差异；造模12周后，与模型组相比，葛花、枳椇子配伍低剂量组的5-HIAA，配伍中剂量组的NE，配伍高剂量组的5-HIAA的含量变化有统计学差异；说明葛花、枳椇子配伍对慢性酒精性肝损伤模型大鼠海马中的5-HT、5-HIAA、DA、HVA、NE和E的含量有调节作用。另外，与模型组相比，造模8周后，东宝甘泰组的5-HIAA和E的含量变化有统计学差异，说明东宝甘泰片对慢性酒精性肝损伤模型大鼠海马的5-HIAA和E的含量有调节作用。东宝甘泰片是临床上治疗脂肪肝、肝硬化和急、慢性肝炎的首选药，为此本实验将东宝甘泰片作为阳性对照药物，本研究发现东宝甘泰片除了对肝损伤的临床疗效，对中枢海马中的单胺类神经递质含量也有一定的调节作用。

本实验在慢性酒精性肝损伤模型的基础上探讨中枢单胺类神经递质含量的变化，可以为研究葛花、枳椇子配伍对酒精性脑损伤的研究奠定基础，并为临床应用葛花、枳椇子防治酒精性相关疾病提供依据。研究提示葛花、枳椇子配伍对慢性酒精中毒患者的学习记忆障碍和精神障碍有改善作用。

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EffectivenessofCompatibilityofFlosPuerariaeLobataeandSemenHoveniaeon7KindsMonoamineNeurotransmittersandTheirMetabolitesinHippocampalTissueofRatswithChronicAlcoholicLiverInjury

WANG Xu1，CHENShaohong1，ZHONGGansheng1*，LIUHaiyan1，WANGXi2，LIUMing1，ZHAOTong1，YUXue1，FANAngran1，ZHANGAozhe1

(1.CollegeofPreclinicalMedicine，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China；2.HebeiUniversityofChineseMedicine，Hebei050200，China)

Objective：To examine the effectiveness of compatibility of Flos Puerariae Lobatae and Semen Hoveniae on 7 kinds of monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampal tissue of rats with chronic alcoholic liver injury from two aspects-the compatibility dosage and dosing cycle.Methods：The rats model with chronic alcoholic liver injury were induced by administrating wine. The rats randomly divided into blank control group，model group， positive control group，and compatibility groups with dose difference (low，medium and high doses). After 4，8 and 12 weeks, hippocampus were rapidly removed and frozen immediately. HPLC-ECD was used to test the expression of monoamine neurotransmitters and their metabolites of hippocampal tissue in rats.Results：After 4 weeks，in comparison to model group，the content of 5-HT in the three compatibility doses groups were changed with statistically significant. The content of NE in the medium and high doses group were changed with statistically significant. The content change of HVA and E in the medium dose group were changed with statistically significant. After 8 weeks，In comparison to model group，the content of 5-HT in the three compatibility doses groups were changed with statistically significant. The content of 5-HIAA in the medium and high doses group were changed with statistically significant；the content change of DA in the medium dose group were changed with statistically significant. After 12 weeks，In comparison to model group，the content of 5-HIAA in the low and high doses group were changed with statistically significant. The content change of NE in the medium dose group were changed with statistically significant.Conclusion：Compatibility of Flos Puerariae Lobatae and Semen Hoveniae could affect the expression of monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampal tissue of rats with chronic alcoholic liver injury.

Flos Puerariae Lobatae; Semen Hoveniae; compatibility；monoamine neurotransmitter；alcoholic liver injury

2015-06-07)

国家自然科学基金(81274104)

*

钟赣生，教授，研究方向：中药基础理论；Tel：(010)64287006，E-mail：zhonggansheng@sohu.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.004