HPLC法测定市售天麻饮片中6种活性成分的含量△

刘思婷，单鸣秋，郭舒臣，钱岩，张丽

(1.南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023；2.南京医科大学附属南京儿童医院，江苏 南京 210008)

HPLC法测定市售天麻饮片中6种活性成分的含量△

刘思婷1，2，单鸣秋1*，郭舒臣1，钱岩1，张丽1

(1.南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京210023；2.南京医科大学附属南京儿童医院，江苏 南京210008)

目的：采用HPLC法同时测定天麻饮片中天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C等6种成分的含量。方法：采用Agilent1220型高效液相色谱仪；HypersilC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为0.5%醋酸水溶液(A)-0.5%醋酸甲醇溶液(B)，洗脱梯度：0～10min，98%A，10～60min，98%～60%A，60～75min，60%A；体积流量为0.8mL·min-1；检测波长为270nm；柱温为30℃；进样量为20μL。结果：6种成分线性关系良好(r≥0.9993)；平均加样回收率在96.99%～101.73%，RSD<2.5%。29批天麻饮片的测定结果表明，云南与四川地区天麻素含量最高。6种成分因地区不同，含量有所差异，其中巴利森苷A类含量最高，对羟基苯甲醇和香荚兰醇含量较低。结论：建立的方法快速简便、稳定可靠，能更全面、有效地对天麻饮片进行质量控制。

天麻；高效液相色谱；含量测定；质量控制

天麻Gastrodiaelata又名赤箭、离母、定风草、明天麻等，为兰科天麻属植物[1]。立冬后至次年清明前采挖(以冬麻为好)，干燥块茎入药，为我国传统名贵药材。天麻早在二千多年前就已入药，以云南昭通产者为优。其性甘、平，归肝经[2]，有抗癫痫、抗惊厥、镇静、镇痛、平肝息风的功能。临床应用证明，其对血管性神经性头痛、脑震荡后遗症等有显著疗效[3-4]。

天麻中含量较高的成分是天麻苷(gastrodin)，也称天麻素，其化学名称为对羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-hydroxymethylphenyl-β-D-glucopyranoside)。现代药理研究证明，其与天麻具有相似的药理作用，被认为是天麻的主要活性成分[5-8]。2015版《中华人民共和国药典》以按干燥品计算，含天麻素与对羟基苯甲醇的总量不得低于0.25%[9]作为质量控制的标准。虽然新版中华人民共和国药典较2010版增加了对羟基苯甲醇的测定，但是仍有较多文献指出，天麻中所含香荚兰醇及巴利森苷类成分也具有较强的生理活性，尤其是巴利森苷类在天麻中含量超过了天麻素与对羟基苯甲醇的含量[10-15]。因此，采用天麻素与对羟基苯甲醇的含量测定作为天麻质量控制的方法不能全面、客观地反映天麻的整体内在质量。

目前国内对于天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的含量测定已有不少报道[13-15]，但大多局限于其中一种或几种成分的测定，同时测定这6种成分的报道较为少见。本研究采用HPLC法测定搜集于不同产地、不同药店的市售天麻饮片中这6种成分的含量，以期更全面、更有效地评价天麻饮片的内在质量。

1 仪器与试药

1.1仪器

ShimadzuLibrorael-40SM型电子分析天平(精确至0.01mg)；Agilent1220型高效液相色谱仪。

对照品天麻素、香荚兰醇(南京泽朗医药科技有限公司，批号分别为00256-2013，01083-2013)；对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C(南京金益柏科技有限公司，批号分别为2014-0192，2014-0078，2014-0079，2014-0080)；甲醇为色谱纯；水为纯净水；其余试剂均为分析纯。

1.2材料

共收集29批天麻饮片(编号为S1～S29)，其产地、批号见表1，均经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为兰科天麻属植物天麻GastrdiaelataB1.的干燥块茎。

2 方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：HypersilC18(250mm×4.6mm，5μm)；

表1 天麻样品编号

流动相：0.5%醋酸水溶液(A)-0.5%醋酸甲醇溶液(B)，梯度洗脱：0→10 min，98%A，10→60 min，98%→60%A，60→75 min，60%A；体积流量：0.8 mL·min-1；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 取各对照品适量，加甲醇-水(3∶97)溶液制成含天麻素(0.603mg·mL-1)、对羟基苯甲醇(0.092mg·mL-1)、香荚兰醇(0.154mg·mL-1)、巴利森苷A(1.556mg·mL-1)、巴利森苷B(0.956mg·mL-1)、巴利森苷C(0.446mg·mL-1)的混合对照品溶液。对照品溶液色谱图见图1。

注：A.对照品溶液；B.供试品溶液；1.天麻素；2.对羟基苯甲醇；3.香荚兰醇；4.巴利森苷C；5.巴利森苷B；6.巴利森苷A。图1 对照品溶液和供试品溶液色谱图

2.2.2供试品溶液的制备 精密称定本品粉末2g，放入具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50mL，振摇2h，称定质量，加热回流3h，放冷，再称定质量，用乙醇补足缺失的质量，摇匀，滤过，精密量取滤液10mL，浓缩至近干，残渣加甲醇-水(3∶97)混合溶液溶解，转移至25mL量瓶中。用甲醇-水(3∶97)混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。供试品溶液色谱图见图1。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系 精密量取混合对照品溶液5mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度。用倍比稀释法以甲醇-水(3∶97)混合溶液制成系列对照品溶液，在2.1项色谱条件下，分别进样20 μL，每个质量浓度进样3次，测定峰面积。以峰面积平均值(Y)与质量浓度(X，μg·mL-1)进行线性回归。结果见表2。

表2 6种成分的回归方程

2.3.2 精密度试验 取编号为S9的天麻样品制成的供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样6次，每次进样20 μL，记录各峰面积，计算RSD。结果天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的峰面积的RSD分别为2.35%、2.79%、1.45%、2.96%、2.34%和0.75%，表明精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取编号为S9的天麻样品制成的供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于0、1、2、4、6、9、12、18 h各进样一次，共8次，每次进样20 μL，记录各峰面积，计算RSD。结果天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的峰面积的RSD分别为1.98%、2.15%、3.52%、2.81%、1.99%和2.21%，表明供试品溶液中6种成分在18 h内稳定。

2.3.4 加样回收率试验 精密称取编号为S9的天麻样品，每份1 g，共6份，精密加入混合对照品溶液2 mL(每mL含天麻素2.286 mg、对羟基苯甲醇0.361 mg、香荚兰醇0.728 mg、巴利森苷A 6.127 mg、巴利森苷B 2.619 mg、巴利森苷C 1.003 mg)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，计算6份样品中6种成分的平均加样回收率和RSD。结果见表3。

表3 6种成分的加样回收率试验

2.4样品含量测定

取29批天麻样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，用外标法计算其中的天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的含量，其结果见表4。

表4 29批饮片中6种成分的含量 /mg·g-1

3 讨论

结果显示，29批天麻饮片中所含6种成分含量差异较大，同一产地饮片中的同一成分的含量相差数倍。分析其原因可能有以下几种：1)地域差异，不同地域的气候、土壤、海拔、光照、温度、湿度均不相同，会对药材生长代谢产生不同的影响；2)种植技术，现有的天麻种植技术大致可分为野生和人工栽培两种。很多文献都提到不同的种植技术会对天麻的质量产生影响[14]，所以同一产地的饮片可能因为种植技术不同而产生较大差异。例如S11与S25两批饮片为野生天麻，该两批饮片的6种成分的含量明显高于同地区其他饮片；3)产地加工方法差异，不同产地对中药材采摘后的加工处理方式不同，有的地区采用蒸的方法，有的采用煮的方法，还有的采用硫磺熏蒸的方式[15]；4)炮制工艺差异，不同地区、不同饮片厂的炮制工艺和炮制设备不同，会对饮片中各种成分的含量产生影响[16]。

在本试验的29批饮片中，除少数几批外，大部分天麻饮片均高于《中华人民共和国药典》标准(2015版一部按干燥品计算，天麻素和对羟基苯甲醇的总量不得少于0.25%)，说明药材质量较好。云南、四川地区天麻饮片中所含6种成分的含量均较高，甚至有两批天麻素含量高于0.7%，巴利森苷A含量高于1.2%。其中云南地区天麻饮片中6种成分的含量较为稳定，而安徽地区差异较大。原因可能是云南产区较近湖南产区，随着湖南产区种植规模的扩大，所产的药材质量也较好[17]。

观察天麻饮片中活性成分的含量趋势可知，天麻饮片中巴利森苷类成分含量最高，按照其含量高低排序为巴利森苷A>巴利森苷B>巴利森苷C，天麻素含量次之，对羟基苯甲醇与香荚兰醇的含量最低。同时，除少数几批天麻饮片中天麻素含量低、巴利森苷类成分含量较高外，大部分同一产地的饮片中天麻素含量越高，巴利森苷类成分的含量越高。从化学结构上观察，巴利森苷A、B、C均为天麻素和柠檬酸结合而成的酯类[15]。由此说明，巴利森苷类成分可能与天麻素存在相互依存或内在转化的关系。因此还需进一步探索巴利森苷类成分对天麻药效的贡献，以及与天麻素之间的依存或转化的关系，为建立更加全面、更有效的天麻质量控制方法提供依据。

[1] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴：第五册[M].北京：科学出版社，2002.

[2] 孙星衍.神农本草经[M].1版.孙冯冀，辑.北京：人民卫生出版社，1982.

[3] 官昌伦，曹光宇，熊波，等.天麻素对偏头痛患者疼痛程度的影响及临床疗效的观察[J].内蒙古中医药，2014，33(8)：2-3.

[4] 贾玉.天麻素治疗血管性神经性头痛临床疗效[J].中国现代药物应用，2015，9(1)：99-100.

[5] 周俊，杨雁宾，杨崇仁，等.天麻化学成分的分离和鉴定[J].化学学报，1997，37(3)：183-189.

[6] 胡海清，夏尔宁，吴梧桐，等.天麻匀多糖的分离纯化和组成分析[J].铁道医学，1988，16(4)：203-204.

[7] 于颖，樊光辉.天麻素的临床应用研究进展.[J].中西医结合心脑血管病杂志，2012，10(9)：1672.

[8] 王莉，肖红斌，梁鑫淼，等.天麻化学成分研究(I)[J].中草药，2003，34(7)：584-585.

[9] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[10] 毕天，李彦文，段靖远，等.天麻抗老年痴呆有效成分的研究进展[J].中医药导报，2013，19(2)：103-106.

[11] 王莉.天麻化学物质基础及质量控制方法研究[D].北京：中国科学院研究生院，2007.

[12] 李秀芳，代蓉，李国花，等.天麻成分对羟基苯甲醇抗血小板聚集作用及急性毒性研究[J].天然产物研究与开发，2013，25(3)：317-320.

[13] 李文兰，范文奇，季宇彬，等.HPLC-ELSD法测定天麻素中天麻苷的含量[J].药物分析杂志，2007，27(1)：126-127.

[14] 程芬，张焜，赵肃清，等.波密栽培天麻与野生天麻中三种有效成分的含量测定[J].中药材，2009，32(7)：1028-1030.

[15] 单鸣秋，张丽，于生，等.HPLC-MS法同时测定天麻饮片中8种活性成分[J].中草药，2015，46(14)：2087.

[16] 尹珉，毛克臣，陈志峰，等.不同炮制方法对天麻中天麻素含量的影响[J].中国中医药信息杂志，2010，17(7)：49-50.

[17] 任守利，刘塔斯，林丽美，等.HPLC测定不同商品规格中天麻苷与天麻苷元的含量[J].中国实验方剂学，2011，17(15)：55-57.

Determinationof6ActiveComponentsinCommerciallyAvailableGastrodiaeRhizomabyHPLC

LIUSiting1，2，SHANMingqiu1*，GUOShuchen1，QIANYan1，ZHANGLi1

(1.CooperativeInnovationCenterofChineseMedicineResourceIndustrializationofNanjingUniversityofChineseMedicine，JiangsuNanjing210023，China；2.NanjingChildren'sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity，JiangsuNanjing210008，China)

Objective：To determine6active components (gastrodin，4-hydroxybenzyl alcohol，vanillyl alcohol，parishin A，parishin B，parishin C) ofGastrodiaeRhizomaby HPLC.Methods：The separation was carried out by an Hypersil C18column (250mm×4.6，5μm) in a mobile phase consisting of0.5%CH3COOH-H2O(A) and0.5%CH3COOH-CH3OH(B) with a gradient elution system (0→10min，98%A；10→60min，98%→60%A；and60→75min，60%A).Detection wavelength was set at270nm and column temperature was30℃.Injection volume was20μL.Results：The six components had good linearity (r≥0.9993).The average recovery rates were96.99%～101.73% with RSD<2.5%.Gastrodiae Rhizoma of29different batches was determined，in which Gastrodiae Rhizoma from Yunnan and Sichuan areas had the highest content of gastrodin.The contents of6components in Gastrodiae Rhizoma varied in different areas.The contents of parishin A was the highest while the contents of4-hydroxybenzyl alcohol and vanillyl alcohol were lower.Conclusion：The method is rapid，simple，accurate and can be used to control quality of Gastrodiae Rhizoma in a more comprehensive and effective way.

Gastrodiae Rhizoma；HPLC；determination；quality control

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.027

2016-03-07)

江苏省中药资源产业化过程协同创新中心项目(ZDXM-1-3)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

*

单鸣秋，副教授，博士，研究方向：中药炮制及饮片质量标准；Tel：(025)85811519，E-mail：shanmingqiu@163.com