龙胆泻肝片质量标准研究

张红玉，胡松谋，刘剑，王继陈

(云南云河药业股份有限公司，云南 个旧 661000)

龙胆泻肝片质量标准研究

张红玉，胡松谋*，刘剑，王继陈

(云南云河药业股份有限公司，云南 个旧661000)

目的：建立龙胆泻肝片的质量标准。方法：采用显微鉴别法对龙胆、黄芩进行定性鉴别；采用薄层色谱法对龙胆、栀子进行定性鉴别；采用HPLC测定龙胆中龙胆苦苷的含量。结果：显微鉴别特征明显；薄层色谱斑点清晰；龙胆苦苷在0.1048～0.6288μg呈现良好的线性关系，相关系数r>0.999；加样回收率为100.4%(n=6)。结论：该方法准确可靠，可行性及重复性好，可用于龙胆泻肝片的质量标准控制。

龙胆泻肝片；显微鉴别；薄层色谱；高效液相色谱；龙胆苦苷；栀子苷

龙胆泻肝片由龙胆、柴胡、黄芩、栀子(炒)、泽泻、木通、车前子(盐炒)、当归(酒炒)、地黄、甘草(蜜炙)10味中药组成，清肝胆、利湿热，用于肝胆湿热、头晕目赤、耳鸣耳聋、耳肿疼痛、胁痛、口苦、尿赤涩痛、湿热带下等。该制剂中的龙胆清热燥湿、泻肝胆火，为方中君药；栀子泻火除烦、清热利湿、凉血解毒，黄芩清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎，同为方中臣药。为了更好地控制产品的质量，保证临床用药安全，采用显微鉴别法对龙胆、黄芩进行定性鉴别；采用薄层色谱法对龙胆、栀子进行定性鉴别；采用HPLC测定龙胆中龙胆苦苷的含量。

1 仪器和试药

1.1仪器

Agilent1100型高效液相色谱仪；赛多利斯电子天平(BP211D)；XSP-44X.9三目生物显微镜(上海光学仪器一厂)。

1.2试药

龙胆苦苷对照品、栀子苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110770-200712，110749-200309，含量测定用)；龙胆泻肝片(云南云河药业股份有限公司，批号为中试01、中试02、中试03)；甲醇(色谱纯，J.T.Baker)。

2 方中龙胆、黄芩的显微特征鉴别

龙胆外皮层细胞表面观纺锤型，每个细胞由横壁分隔成数个小细胞。黄芩韧皮纤维淡黄色，梭形，壁厚，孔沟细[1]。见图1。

注：A.黄芩；B.龙胆。图1 龙胆泻肝片显微特征图

注：1.龙胆泻肝片样品(云河：中试01)；2.龙胆泻肝片样品(云河：中试02)；3.龙胆泻肝片样品(云河：中试03)；4.龙胆苦苷、栀子苷；5.阴性样品(缺龙胆、栀子)。图2 龙胆泻肝片中龙胆、栀子薄层鉴别的二次展开色谱图

3 薄层色谱鉴别

栀子、龙胆的薄层色谱鉴别[3]：取本品10片(薄膜衣片除去薄膜衣)，研细，加乙醇30mL，超声(功率为250W，频率为33kHz)处理30min，滤过，滤液浓缩成约1mL，加在中性氧化铝柱(120目，2g，内径1.5cm)上，用乙醇洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1mL使其溶解，作为供试品溶液。另取栀子苷、龙胆苦苷对照品，加甲醇制成质量浓度为4mg·mL-1的栀子苷对照品溶液和质量浓度为1mg·mL-1的龙胆苦苷对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水(30∶10∶3)的下层溶液为展开剂，二次展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。按处方中各味药的比例取不含龙胆、栀子的群药，按制备工艺制备阴性样品后，按供试品溶液的制备方法制成阴性溶液。本法经三批样品试验观察，阴性对照未见干扰。见图2。

4 HPLC测定龙胆中龙胆苦苷的含量

4.1色谱条件

AgilentC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以甲醇-水(22∶78)为流动相[2-4]；检测波长为270nm；流速为1mL·min-1；进样量为10μL；理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于2500。

4.2对照品溶液的制备

取龙胆苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为50μg·mL-1的溶液，即得。

4.3供试品溶液的制备

取本品(薄膜衣片除去薄膜衣)研细，精密称取0.5g，置50mL量瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率为250W，频率为33kHz)45min，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.4阴性溶液的制备

按处方中各味药的比例取不含龙胆的群药，按制备工艺制备阴性样品后，按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

4.5专属性试验

取按龙胆泻肝片生产工艺制成缺龙胆的阴性样品0.5g，按4.3项下方法制备阴性对照液，按4.1项下方法测定，结果在与龙胆苦苷对照品色谱相应的保留时间处，供试品溶液色谱图中有吸收峰，而阴性对照色谱图中未显吸收峰，可见溶剂对主成分无干扰，说明本法专属性强。见图3。

注：A.龙胆苦苷对照品；B.龙胆泻肝片样品；C.龙胆泻肝片缺龙胆阴性样品。图3 龙胆泻肝片液相色谱图

4.6线性关系考察

取对照品溶液，在按4.1项下的色谱条件，分别精密量取2、4、6、8、10、12μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以进样量对峰面积进行回归。采用的HPLC法测定龙胆泻肝片中龙胆苦苷在0.104 8～0.628 8μg呈良好线性关系，回归方程为Y=0.968 658 624+1 246.154 59X,相关系数r>0.999。

4.7精密度考察

取龙胆苦苷对照品溶液，按4.1项下的色谱条件测定，平行操作6次，记录峰面积，结果龙胆苦苷的RSD为0.38%，表明精密度良好。

4.8重复性考察

取同一批样品(批号为：中试01)分别制备6份供试品溶液，按4.1项下色谱条件测定，记录峰面积，测定结果龙胆苦苷的含量分别为1.728、1.730、1.729、1.729、1.727、1.732mg/片，RSD为0.01%，表明该方法重复性良好。

4.9稳定性试验

取同一批样品(批号为：中试01)供试液，分别于0、4、8、12、24h进行测定，记录峰面积，测定结果龙胆苦苷的含量分别为1.727、1.726、1.728、1.728、1.726，RSD为0.06%，表明供试品溶液在24h内稳定。

4.10加样回收率试验

取同一批样品(批号为：中试01，已知样品中龙胆苦苷的含量为4.2216mg·g-1)，研细，取6份，每份约0.25g，精密称定，分别置50mL量瓶中，分别加入龙胆苦苷对照品溶液(质量浓度为0.1264mg·mL-1)5mL，按供试品溶液制备方法制备后，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定，计算回收率，即得，测定结果见表1。

表1 加样回收率试验

结果表明，龙胆苦苷的回收率均在99.84～102.42%，其他成分对测定无干扰，方法可行。

4.11样品测定

取龙胆泻肝片(批号为：中试01、中试02、中试03)，按4.3项下条件制备样品溶液，按4.1项下色谱条件测定龙胆苦苷的含量，以外标法计算，结果均为1.73mg/片。

5 讨论

方中木通薄层色谱鉴别方法[5]，因其化学成分为茎枝含木通苷，木通苷极易水解得常春藤皂苷元、齐墩果酸、葡萄糖和鼠李糖，根据其化学成分，用齐墩果酸对照品、常春藤皂苷元对照品作对照，对其鉴别进行了研究。结果显示，龙胆泻肝片由10味中药组成，成分复杂，干扰成分多。在鉴别木通中齐墩果酸时，阴性有干扰，经文献查阅得知，车前子化学成分中含有熊果酸和齐墩果酸，同属三萜酸同分异构体，性质与化学结构较为相似，用TLC法鉴别时很难将其分开，二者相互干扰。按《中华人民共和国药典》2010版一部木通药材项下的方法鉴别常春藤皂苷元时，供试品背景颜色深，斑点层次模糊。采用过大孔树脂柱、中性氧化铝柱等洗脱处理，除去了背景颜色，但斑点模糊，阴性有干扰，专属性差，因此未将其列入质量标准草案正文。

最大吸收波长的选择：取龙胆苦苷对照品，加甲醇使其溶解，制成龙胆苦苷对照品溶液，分别在200～400nm做紫外扫描，从紫外光谱图可以看出，在270nm处龙胆苦苷有较大吸收值，故选择检测波长为270nm。

龙胆苦苷、栀子苷的薄层鉴别中，由于成份复杂，较难分离，经过大量研究，最终确定用高效薄层板，以同一展开剂，展开2次的方法进行分离，得到的结果较理想。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂：第十二册[S].北京:中国医药科技出版社，1997.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S]北京:中国医药科技出版社，2010.

[3] 刘颖，胡琴，陶志国.龙胆泻肝颗粒质量标准研究[J].中成药，2013,35(12)：2661-2666.

[4] 许仲，叶胜体，张妥.高效液相色谱法测定龙胆泻肝汤颗粒中龙胆苦苷含量[J].中国药业，2012，4(21)：54-55.

[5] 刘卫国.木通中齐墩果酸含量及其指纹图谱研究[D].成都：四川工业大学，2005.

QualityStandardforLongdanXieganTablets

ZHANGHongyu,HUSongmou*,LIUJian,WANGJichen

(YunnanYunhePharmaceuticalCo.，Ltd，YunnanGejiu661000，China)

Objective：To establish a quality standard for Longdan Xiegan Tablets.Methods：Microscopic identification was used by qualitative identification ofGentianascabraBge andScutellariabaicalensisGeorgi; TLC was used for qualitative identification ofG.scabraandGardeniajasminoidesEllis; HPLC was used for the determination of gentiopicrin ofG.scabra.Results：Microscopic identification showed obvious characteristics，TLC spots were clear; the linear ranges of gentiopicrin was0.1048～0.6288μg (r>0.999).Rate of recovery was100.4%(n=6).Conclusion：The method is accurate reliable and reproducible and can be used for quality control of Longdan Xiegan Tablets.

Longdan Xiegan Tablets；microscopic identification；TLC；HPLC；gentiopicrin；geniposide

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.024

2015-08-05)

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胡松谋，主任药师，研究方向：中成药开发与研究；Tel：(0873)2122589，E-mail：393153902@qq.com