全蝎三种产地加工方法的对比研究△

孙静，王集会

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学 实验中心，山东 济南 250355)

全蝎三种产地加工方法的对比研究△

孙静1，王集会2*

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南250355；2.山东中医药大学 实验中心，山东 济南250355)

目的：比较三种产地加工全蝎粉的含水量、含盐量、醇提取物含量、蛋白质含量、平衡吸湿量以及牛磺酸含量的不同，找出最适合的产地加工方法。方法：用快速水分测定仪测定含水量；用滴定法测定全蝎粉含盐量；用lowry法测定蛋白质含量；用重量法测定醇提取物含量；用平衡吸湿曲线测定临界相对温度(CRH)值；用高效液相外标一点法测牛磺酸含量。结果：比较三种产地加工方法在各种指标上的差异性，结果显示，常温风干蝎和冷冻干燥蝎之间差异较小，而高温盐蝎与前两者之间有显著差异。结论：全蝎冷冻干燥和常温风干可作为产地加工方法。

全蝎粉；产地加工方法；蛋白质；临界相对温度；牛磺酸

全蝎是我国传统的中药材，具有息风镇痉、通络止痛、攻毒散结等功能。现代研究表明，鲜全蝎含有蝎毒、牛磺酸、软硬脂酸等蛋白质及非蛋白质成分[2]。其中蝎毒素为可溶性蛋白，是一种含碳、氢、氧、氮、硫等元素的毒性蛋白。全蝎的醇提取物及蝎毒粗毒是抗癌的主要活性成分[3]，现已成为治疗多种疑难病的临床药物。

产地加工是影响全蝎药材质量的重要因素。盐水煮沸风干、淡水煮沸风干使可溶性蛋白等有效成分丧失，为此我们尝试将野生活蝎捕捉后快速清水漂洗，除去泥沙，-18 ℃直接冷冻冻死，粉碎，自然风干和冷冻干燥。为了考察不同产地加工方法全蝎粉的质量，我们选择含水量、含盐量、醇提取物含量、蛋白质含量、平衡吸湿量以及牛磺酸含量等指标进行分析研究，拟找出全蝎最佳产地加工方法。

1 材料与仪器

1.1材料

氯化钠、铬酸钾指示剂、硝酸银溶液、乙醇、硫酸溶液、Lorry试剂、福林酚试剂(国药集团，分析纯)；正己烷、冰醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)；乙腈(上海星可高纯溶剂有限公司，色谱纯)；三乙胺(天津市化学试剂一厂，分析纯)；牛磺酸(中国食品药品检定研究院)。

野生全蝎购自山东临沂，均为野生活蝎，选择成年蝎，剔除幼蝎，经山东中医药大学生药系鉴定为钳蝎科东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch。高温盐蝎按《中华人民共和国药典》一部制取，自然风干粉按参考文献[4]进行加工，冻干粉自制。

1.2仪器

冠亚牌SPF系列快速卤素水分测定仪(深圳市冠亚电子科技有限公司)；FA1004N型电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；智能编程层析柜(上海嘉鹏科技有限公司)；SKB-Ⅲ循环水式多用真空泵disb-zc(郑州长城科工贸有限公司)；四环冻干机LGJ-18A(北京四环科学仪器厂有限公司)；LC-10ATVP(日本岛津公司)；MettlerAE240电子天平(瑞士梅特勒公司)。

2 方法

2.1全蝎冻干粉加工方法

取野生全蝎，清水漂洗，去净泥沙，冻结，打碎成浆，预冷冻。将预冷冻好的全蝎粉放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-60℃，真空度为1Pa，物料温度为25℃，环境温度25℃，冷冻干燥24h即得。

2.2含水量的测定

取3种全蝎粉各0.5g，平铺于快速水分测定仪的托盘上，按仪器使用说明测定。

2.3含盐量的测定

2.3.1 供试液制备 取3种全蝎粉各5g，精密称定，放在三角烧杯中，加水90mL，浸泡30min，超声波震荡10min，加热至微沸30min，过滤，滤液备用。滤渣加水70mL，泡20min，微沸20min，过滤，滤渣再加水50mL，微沸20min，冲洗滤渣，滤液并用，定容至250mL量瓶中备用[4]。

2.3.2 供试液滴定 分别取3种供试液各25mL，滴加1mL铬酸钾指示剂，充分混匀后，用硝酸银滴定液(0.100 0mol·L-1)滴定至溶液出现砖红色，用硝酸银的消耗量推算出氯化钠含量。

2.4醇提取物的测定

称定供试品约2～4g(精密称定)，置250mL锥形瓶中，精密加20%的乙醇100mL，密塞，称定质量，静置1h。连接回流冷凝管，加热沸腾，保持微沸1h，冷却至室温。取锥形瓶密塞称质量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25mL，置干燥后的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3h，干燥器中冷却30min，迅速精密测定醇提物质量[5]。

2.5蛋白质含量的测定

牛血清蛋白的标准曲线的测定[6]：标准曲线方程为Y=2.141 3X+0.007 1[Y为吸光度，X为蛋白质浓度(mg·mL-1)]，相关系数r=0.999 0，线性关系良好。

取3种粉末各0.5 g于小锥形瓶中，加入20 mL水超声30 min，分离上清液后，再加入20 mL水超声30 min，抽滤后，将3种溶液定容到100 mL，离心，取1 mL用Lowry法测定蛋白质含量。

2.6平衡吸湿量的测定

取各种样品供试品分别置于7～9个不同相对湿度的密闭干燥器中，相对湿度为10%～100%，即得各相对湿度下的平衡吸湿量。以吸湿率为纵坐标，相对湿度为横坐标作图，得吸湿曲线。将吸湿曲线陡直部分延长与横坐标相交，即为样品CRH。

2.7牛磺酸含量测定

2.7.1 衍生化试剂制备 精密量取0.3mLPITC，置于25mL棕色量瓶中，用乙腈稀释至刻度，浓度为0.1mol·L-1，摇匀，4 ℃保存，作为PITC的乙腈溶液；精密量取14mL三乙胺，置于100mL棕色量瓶中，用乙腈稀释至刻度，浓度为1mol·L-1，摇匀，作为三乙胺的乙腈溶液[7]。

2.7.2 对照品溶液制备 精密称取牛磺酸对照品10.43mg，用蒸馏水溶解并定容至25mL，制成质量浓度为0.417 7mg·mL-1的对照品溶液A。

2.7.3 样品溶液的制备 精密称取3种全蝎粉末各0.5g，按最佳超声提取工艺提取，定容至100mL。

2.7.4 衍生化步骤 精密吸取待分析溶液5mL于25mL棕色量瓶中，精密加入0.1mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5mL，1mol·L-1三乙胺的乙腈溶液2.5mL，摇匀，室温放置1h后，加50%的乙腈稀释至刻度，摇匀。精密移取5mL，加入5mL正己烷，振摇后放置10min，取下层溶液，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得。

2.7.5 色谱条件AgilentZORBAXSB-C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)以0.07mol·L-1醋酸-醋酸钠缓冲液-2.5%乙腈(pH=6.5)为流动相A，以乙腈-甲醇-水(40∶15∶45)为流动相B,进行梯度洗脱：0～15min96.5%→89%A，15～30min89%→0%A，30～45min0%A；检测波长为254nm；流速为1.0mL·min-1；进样量为5μL。用外标一点法测定牛磺酸含量。

2.7.6 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品溶液(质量浓度为0.417 7mg·mL-1)，用水稀释成6个不同浓度的对照品稀释液，按上述方法进行衍生化，并按上述色谱条件测定峰面积，以牛磺酸对照品进样量(μg)为横坐标X，峰面积值为纵坐标Y，以最小二乘法计算回归方程。

2.7.7 精密度试验 取上述对照品溶液进行衍生化，并测定峰面积，连续进样5次。

2.7.8 重复性试验 分别称取3种样品各3份，精密称定，按最佳超声提取工艺提取并进行衍生化，按上述色谱条件测峰面积，计算样品中牛磺酸平均含量。

2.7.9 加样回收率试验 称取已知牛磺酸含量的样品3份，每份0.104 9 g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入牛磺酸对照品溶液(质量浓度为0.412 8 mg·mL-1)1.0 mL，水19 mL，密塞，称定质量。按最佳超声工艺超声处理，制备样品溶液，进行色谱分析，计算回收率。

3 结果

3.1含盐量、含水量、醇溶物含量及蛋白质含量

见表1。

表1 3种全蝎粉含盐量、含水量、醇溶物含量及CRH数值

注：*、**表示单因素方差分析各组之间差异有统计学意义，P<0.01。

3.2三种全蝎粉的CRH

见图1。

注：A.高温盐蝎；B.常温风干蝎；C.冷冻干燥蝎。图1 3种全蝎粉相对湿度

3.3高效液相色谱图

见图2。

注：A.牛磺酸标准品；B.冷冻干燥蝎；C.高温盐蝎；D.常温风干蝎；E.阴性对照。图2 3种全蝎粉、牛磺酸标准品阴性对照品的牛磺酸高效相色谱

3.4标准曲线方程及线性范围

标准方程为Y=1273400X+62009，r=0.9991。在0.08354～0.4177μg进样量与峰面积之间呈良好的线性关系。

3.5精密度试验

取标准品5份，与试验组用相同衍生法处理后，用高效液相法测定牛磺酸峰面积，峰面积平均值为1387200.093，RSD为1.84%，表明本方法精密度良好。

3.6加样回收率试验

见表2。

表2 3种全蝎粉的加样回收率

3.7三种样品牛酸含量

见表3。

表3 3种全蝎粉的磺酸含量

3.8重复性试验

称取全蝎粉样品3份，精密称定，按最佳超声提取工艺提取并进行衍生化，按上述色谱条件测峰面积，计算出样品中牛磺酸平均含量为121.9mg·g-1，经计算RSD为3.2%，表明该方法重复性良好。

4 讨论

4.1含盐量

高温盐蝎的含盐量是其他两种加工方法的20倍，据报道有些品种全蝎药材的含盐量可达到100%～300%，而目前《中华人民共和国药典》2010版也未对全蝎药材的含盐量作出明确的限定。含盐量过高使全蝎药材的实际用药量下降，既不利于准确用药，也不利于判断药材质量的优劣。

4.2醇提取物含量

实验中用20%的乙醇做溶剂，提取出来的物质主要是水溶性的成分。高温盐蝎中含有大量的盐，所以其醇提取物含量较高，可能是盐的因素。

4.3蛋白质含量

高温盐蝎加工时会使蛋白质流失，使蝎子粉中有效成分降低。

4.4CRH

全蝎中既有水不溶性的动物纤维,又有水溶性的蛋白质、酸性黏多糖等成分，因此为两性混合物。高温盐蝎由于含有大量的盐分，CRH值较小，大约在50%左右。冷冻干燥蝎由于干燥方式的原因，药材的形态较疏松，水分已进入药粉内部，所以也易吸潮。自然风干的全蝎粉较密实，较不易吸湿，所以，根据三者的CRH，高温盐蝎和冷冻干燥蝎在储藏中尤其应注意密闭低温保存。

4.5牛磺酸含量

实验中的HPLC图有两个较大的峰，一个是牛磺酸，峰在25min左右；另一个是衍生化试剂PITC的峰，在38min左右。通过计算得出，冷冻干燥蝎牛磺酸含量最高，为111.10mg·g-1，其次为风干蝎，含量为82.96mg·g-1，最低为高温盐蝎，含量为39.12mg·g-1。这可能是因为高温盐蝎在产地加工过程中随煮沸水的弃去而流失，所以冷冻干燥是最有利于保存牛磺酸的制作工艺。

由以上讨论可知，沸水煮全蝎并不是最适宜的产地加工方式，将捕捉到的野生全蝎直接冻死后粉碎成粉，冷冻干燥或直接自然风干能最大限度地保留全蝎的蛋白质和牛磺酸等活性成分，更有利于保护全蝎的药用价值。

[1] 陈秀敏.全蝎不良反应分析[J].时珍国医国药，2003，14(10)：635.

[2] 王燕平，吕欣然.东亚钳蝎蝎毒分离纯化及药理作用的研究进展[J].中草药，2000，31(1)：59-61.

[3] 张红梅，刘岩峰，张景海.蝎及蝎毒抗肿瘤作用研究进展[J].沈阳药科大学学报，2006，23(6)：401.

[4] 王集会，曲仕明，高世杰.全蝎两种产地加工方法的对比研究[J].山东中医杂志，2009，28(2):131-132.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社,2010.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].北京：中国医药科技出版社,2010.

[7] 蒲秋易，张一竹，张二云，等.柱前衍生化高效液相色谱法测定全蝎中游离牛磺酸的含量[J].中国新药杂志，2013(02):230-234.

ComparativeStudyofThreeHabitat-processingMethodforButhusmartensiiKarsch

SUNJing1，WANGJihui2*

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicineofPharmacy,Jinan250355,China；2.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicineofexperimentcenter,Jinan250355,China)

Objective：Three habitat-processing method for Buthus martensii Karsch were compared with each other in the aspects of water，salt，protein，taurine concentration，alcohol extracts and CRH.Methods：The water concentration was measured with the rapid moisture check device,the salt with titrametric analysis，the protein with Lowry method，the alcohol extracts’ with gravimetric method，the CRH value with the balance curve line of the moisture absorption，the taurine with external standard one point method and HPLC.Results：By comparing the difference between the various indicators in every index，the lyophilization and the air dry have little difference，but the high temperature has much significance difference.Conclusion：The lyophilization and nature drying are availiable ways of the three habitat-processing methed for B. martensii.

Buthus martensii Karsch；habitat-processing method；protein；CRH； taurine

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.022

2015-04-21)

山东中医药大学大学生研究训练(SRT)计划资助项目(201310441026)；山东省科技发展计划项目(2013GSF11908)

*

王集会，副教授，研究方向：虫类中药发酵及活性成分研究;E-mail：wangjihui10@126.com