大孔树脂对黄芪总皂苷的分离纯化研究△

王登斌，邹准，陈文财，邹节明

(桂林三金药业股份有限公司，广西 桂林 541004)

大孔树脂对黄芪总皂苷的分离纯化研究△

王登斌，邹准，陈文财，邹节明*

(桂林三金药业股份有限公司，广西 桂林 541004)

目的：优化黄芪中黄芪总皂苷的分离和纯化工艺。方法：以总皂苷为指标，考察5种商品化大孔树脂(D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130)在静态和动态情况下对黄芪总皂苷的吸附和解吸性能。结果：HPD300树脂纯化效果最好，当按上柱生药量∶树脂量=2∶1的吸附量吸附，4 BV 70%乙醇洗脱时，分离纯化效果最佳。黄芪甲苷的洗脱率达86.5%，纯度为33.8%。结论：优化后的大孔树脂纯化工艺稳定，适于黄芪总皂苷的分离和纯化。

黄芪；黄芪甲苷；大孔树脂；高效液相色谱-蒸发光散射法

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。其主要成分为皂苷类、多糖类及黄酮类。现代药理研究表明，黄芪总皂苷具有稳定红细胞膜、提高血浆组织内环腺苷酸(CAMP)的含量、增强免疫力、抗疲劳、耐缺氧等多种药理作用[1]。

大孔树脂吸附是20世纪70年代开发应用的吸附分离材料，其吸附分离过程综合了机械筛分和化学吸附原理，具有吸附性独特、选择性高、不受无机物影响、使用周期长、节省费用等优点，广泛应用于皂苷类物质的提取[2-3]。有关大孔树脂对中药中皂苷类和黄酮类成分纯化的报道已有不少[4]，但对黄芪中总皂苷类成分的相关报道相对较少[5-6]。本文从5种不同极性的大孔树脂中筛选出一种型号为HPD300的树脂，并研究了该树脂对黄芪提取液中黄芪总皂苷在静态和动态下的吸附解吸性能，为工业分离纯化黄芪总皂苷提出了技术性探索。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Alliance高效液相色谱系统、2695高压泵(美国Waters公司)；Alltech-6000蒸发光散检测器(Alltech公司)；phenomenex luna C18柱(美国菲罗门公司)；分析天平(日本Mettler公司)；HZS-HA恒温振荡器(哈尔滨东明医疗仪器厂)。

1.2 材料

黄芪药材购自广西中南药业；黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110781-201314)；D101、AB-8(天津南开大学化工厂)；HPD300、HPD600、DM130(沧州宝恩生化制剂厂)；色谱级乙腈(TIDA公司)。

2 方法与结果

2.1 黄芪甲苷的测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：phenomenex luna C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：乙腈-水(35∶65)；漂移管温度：88 ℃；氮气流速：2.4 mL·min-1。

2.1.2 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品，精密称定，加甲醇稀释成质量浓度为0.492 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取黄芪提取物约50 mg，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.4 标准曲线的制备 取2.1.2项下的对照品溶液，精密吸取2、4、6、8、10 mL，分别移至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。分别吸取各标准液20 μL，注入液相色谱仪，按2.1.1色谱条件测定峰面积。以黄芪甲苷进样量(μg)的常用对数值为横坐标(X)，峰面积常用对数值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=2.208 6X+9.675 3，r=0.999 3。结果表明，黄芪甲苷在1.968～9.840 μg有良好的线性关系。

2.1.5 样品测定 按2.1.3项下的方法制备供试品溶液，依法测定，计算黄芪甲苷的量。色谱图见图1～2。

2.2 黄芪的提取和纯化

2.2.1 黄芪提取液的制备 取黄芪药材5 kg，加入含2%氢氧化钠(NaOH)的70%乙醇溶液，提取2次，每次2 h，滤过，合并滤液。回收乙醇至无醇味，加水适量，高速离心，稀释成0.4 g·mL-1(生药计)的样品液，作为提取液。经测定，黄芪甲苷的质量浓度为为8.12 mg·mL-1。

图1 黄芪甲苷对照品色谱图

图2 大孔树脂纯化后的黄芪提取物供试样色谱图

2.2.2 树脂的选择 参照文献[7]方法，取D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130 5种树脂，用95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀，然后用95%乙醇不断冲洗，至1份流出液加3份纯化水不出现浑浊为止，再用纯化水冲洗至无醇味，备用。

不同吸附树脂对黄芪甲苷的静态饱和吸附实验：称取预处理过的D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130各5 g，置具塞锥形瓶中，分别加入黄芪提取液各50 mL，塞紧瓶塞，置于振荡器上，振摇吸附24 h，使树脂对黄芪提取液中黄芪甲苷的吸附达到平衡状态，静置，滤过，得吸附后黄芪甲苷溶液；再将静态吸附的树脂抽干，加30 mL 95%乙醇解吸，放入摇床上振荡6 h，滤过，得黄芪甲苷洗脱液。分别取吸附后溶液、洗脱液各2 mL，蒸干，按2.1.3项下方法制得供试品溶液，测得溶液中黄芪甲苷量，计算吸附率和洗脱率。结果见表1。

表1 5种树脂对黄芪甲苷的静态吸附-洗脱性能实验结果

由上表1中吸附率可看出：吸附率排序为HPD600>HPD300>AB-8>DM130>D101；解吸率排序为HPD300>AB-8>DM130>HPD600>D101。结果表明，静态吸附实验中，HPD300、AB-8型树脂对样品中黄芪甲苷的吸附率和洗脱率均高于D101、DM130树脂，HPD600型树脂吸附率虽高，但洗脱率太低。考虑到静态吸附与动态吸附之间存在一定差异，我们选取静态吸附、解吸性能较好的HPD300、AB-8型树脂，进一步考察其对黄芪甲苷的动态吸附性能。

HPD300、AB-8吸附树脂对黄芪甲苷的动态饱和吸附实验：取预处理过的HPD300、AB-8适量，分别湿法装柱(17 cm×1.5 cm)，柱体积约为30 mL，以质量浓度为0.4 g·mL-1(生药计)的黄芪提取液上样，流速为2 BV·h-1，分别收集流出液，每流出15 mL(相当于0.5 BV)收集1瓶，作为一组份，测定黄芪甲苷含量，绘制各树脂的泄漏曲线，结果见图3。

图3 HPD300、AB-8树脂动态吸附泄漏曲线

由图3可见，等量柱体积的HPD300、AB-8两种树脂，对同一黄芪提取液进行动态吸附，HPB300出现泄漏点和达到吸附饱和时，所加黄芪提取液量均高于AB-8树脂，说明HPB300树脂动态饱和吸附量大于AB-8树脂。

HPD300、AB-8吸附树脂对黄芪甲苷的动态解吸实验：取预处理过的HPD300、AB-8适量，分别湿法装柱(17 cm×1.5 cm)，柱体积约为30 mL，以质量浓度为0.4 g·mL-1(生药计)的黄芪提取液上样，以2 BV·h-1的流速吸附后，先用2 BV水洗脱，再用70%乙醇以2 BV·h-1的流速洗脱，每流出15 mL(相当于0.5 BV)收集1瓶，作为一组份，测定黄芪甲苷含量，绘制解吸曲线，结果见图4。

图4 HPD300、AB-8树脂动态解吸曲线

由图4可见，HPD300对黄芪甲苷的解吸效果优于AB-8。综合两种吸附树脂对黄芪甲苷的动态吸附和解吸性能，选用HPD300树脂来分离纯化黄芪提取液中总皂苷效果最佳。

2.2.3 洗脱剂浓度的筛选 将一定量的黄芪提取液通过树脂柱，流速为2 BV·h-1，吸附结束后，用水洗至流出液不显Molish反应，再依次用10%、30%、50%、70%、90%洗脱剂洗脱，速度为2 BV·h-1，每个浓度洗脱4 BV，收集洗脱液，测定洗脱液中黄芪甲苷的含量。以测定结果绘制解吸曲线，见图5。

注：1～4号10%乙醇解吸液；5～8号30%乙醇解吸液；9～12号50%乙醇解吸液；13～16号70%乙醇解吸液；17～20号90%乙醇解吸液。图5 不同洗脱剂浓度乙醇对黄芪甲苷纯化的影响

洗脱曲线显示，黄芪甲苷主要集中在50%、70%乙醇洗脱液中。另取黄芪提取液2份，每份30 mL，分别上柱，先用2 BV水洗脱，再分别用50%、70%乙醇溶液各100 mL洗脱，测定黄芪甲苷洗脱率分别为71.2%、88.5%，70%乙醇的解吸效果优于50%乙醇，故确定洗脱条件为先水洗去杂质后，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱部分。

2.2.4 吸附容量的确定 取处理后的大孔树脂3根，吸取黄芪提取液40 mL，上柱，预吸附1 h，过柱流出液重吸附1次，静置吸附12 h，先用2 BV水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，平行测定3次，测定黄芪甲苷含量，计算吸附容量。结果见表2。

表2 黄芪甲苷吸附容量的测定

注：吸附容量=(上柱液中黄芪甲苷含量-过柱液中黄芪甲苷含量)/树脂干重。

2.2.5 上样量的确定 取质量浓度为0.4 g·mL-1(生药计)的黄芪提取液上样，以0.5 BV为单位收集流出液，测定黄芪甲苷含量，考察黄芪甲苷泄漏点。结果显示，出现泄漏的最高量为4 BV柱体积。折算成黄芪生药量与树脂量的比例为2.2∶1，考虑生产实际偏差，确定上柱生药量与树脂量之比为2∶1。

2.2.6 洗脱剂量的确定 取120 mL的黄芪提取液，通过预处理过的HPD300树脂层析柱(1 BV=30 mL)，吸附结束后，先用2 BV水洗脱，弃去。再用70%乙醇以2 BV·h-1的速度进行洗脱，按顺序每0.5 BV收集1瓶，共收集9瓶。测定各号瓶中黄芪甲苷的含量，以测定结果绘制动态解析曲线。见图6。

由图6可知，用4 BV 70%乙醇溶液，可将吸附的黄芪甲苷解析下来，因而确定洗脱剂用量为4倍柱体积的70%乙醇溶液。

图6 黄芪甲苷的动态解吸曲线

分别取上柱液、过柱液、解析液适量，蒸干，按2.1.3项下的方法制得供试品溶液，测定，计算黄芪甲苷动态吸附率和解析率，结果见表3。

表3 HPD300树脂对黄芪甲苷的吸附率与解析率

2.2.7 验证试验 按上述试验得出的优选工艺条件进行3次验证试验，分别取黄芪提取液(黄芪甲苷质量浓度为8.12 mg·mL-1)2000 mL，通过装有预处理过的400 g HPD300树脂柱中，先用2 BV水洗脱，弃去。再用4 BV 70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱部分，浓缩，干燥，得黄芪提取物，测定。结果见表4。

表4 3次验证试验测定结果

2.2.8 大孔树脂使用次数考察 取3份预处理过的HPD300树脂，分别湿法装柱，各吸取黄芪提取液40 mL，以2 BV·h-1的流速吸附后，先用2 BV水洗脱，再用4 BV 70%乙醇以2 BV·h-1的流速洗脱。分别收集过柱液、洗脱液，测定黄芪甲苷含量，计算树脂柱吸附容量。最后用适量蒸馏水冲洗树脂至滴出液无醇味，不经再生，重复以上操作，以使用次数为横坐标，吸附容量为纵坐标作图，见图7。

图7 HPD300树脂柱连续使用过程中黄芪甲苷吸附容量的变化

由图7可知，树脂初次使用时，黄芪甲苷吸附容量约为61.8 mg·g-1，使用次数增加，树脂吸附能力有所下降。本实验中，连续使用18次后，黄芪甲苷吸附容量为原来的72.1%。因而可认为树脂首次使用后，在连续使用18次后，需要经过再生后才能使用。

2.2.9 大孔树脂再生方法考察 一般来讲，用95%乙醇洗脱至无色，再水洗至无醇味，即可再用。但若树脂受污染严重，颜色变深，吸附能力降低，应用强酸碱液再生处理。本实验中树脂使用18次后颜色略有变深，因而考虑用95%乙醇洗脱再生。

对已使用过18次的HPD300树脂，先用95%乙醇浸泡2 h，装柱，再用95%乙醇洗至滴出液无色，最后用大量水洗至无醇味，再重新上样，考察再生后树脂柱的吸附容量、吸附率，实验结果见表5。

表5 95%乙醇洗脱再生工艺考察

结果表明，用95%乙醇再生后，树脂对黄芪甲苷的吸附容量可达到新树脂的95.5%，再生连续使用3次，树脂对黄芪甲苷的吸附容量可达到新树脂的93.6%。由此说明，采用95%乙醇洗脱对树脂进行再生是可行的。

3 讨论

黄芪甲苷是黄芪药材重要的药效活性物质，但其含量较低，各产地药材间差别较大[8]，质量控制较为困难。近年来，多篇文献[9-12]报道了在黄芪药材提取或制剂分析中采用碱液处理方法，以提高黄芪甲苷的含量。本实验中，我们通过优化工艺参数，选择水解条件相对温和的碱性乙醇回流提取黄芪总皂苷。通过皂化反应，将黄芪中众多环黄芪醇皂苷配糖体上含-OAC基团转化为-OH，提高了黄芪甲苷的含量。经测定，水解前后样品中总皂苷含量无明显差异，但水解后样品中黄芪甲苷的含量增加了近20倍。由于总皂苷中各种原生皂苷的种类和比例通过碱液水解后有了较大的变化，黄芪甲苷含量显著提高后与原总皂苷相比是否具有增效作用还需结合具体功能作进一步的药理验证。

本文通过5种大孔树脂对黄芪总皂苷的吸附、纯化性能的对比筛选，最后选定HPD-300型树脂作为纯化树脂。黄芪提取物经HPD-300树脂精制后，黄芪甲苷含量可达33.8%，精制度平均可达545.2%。

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StudyonSeparationandPurificationofTotalSaponinsfromRadixAstragaliwithMacropereResin

WANG Dengbin，ZOUZhun，CHENWencai，ZOUJieming*

(GuilinSanjinPharmaceuticalCo.，Ltd.，Gangxi，Guilin541004，China)

Objective：To optimize the separation and purification processes of total saponins from Radix Astragali.Methods：The adsorption and desorption properties of total saponins of Astragalus(D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130)under static and dynamic conditions were investigated with the content of total saponins as index。Results：The purification effect of HPD300 resin was optimal，when the loading quantities was 2∶1(crude drug of Radix Astragali：macropere Resin)，With 70% ethanol as eluant，the amount was 4BV.The Desorption ratio and product purity reached 86.5% and 33.8% separately.Conclusion：The optimized macroporous resin purification process is stable and feasible，and can be used for separation and purification of total saponins of Astragalus.

Macropere resin；Radix Astragali；Astragaloside Ⅳ；HPLC-ELSD

2015-07-15)

广西科技攻关项目(桂科攻14124004-2-10)

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邹节明，教授级高工，研究方向：中药现代化；Tel：(0773)5842588，E-mail：zjm@sanjin.com.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.019