HPLC法同时测定左归饮提取物中马钱苷和5-羟甲基糠醛的含量

卢春雪，杨绍杰，陶荟竹，黄树明，杨书彬

(黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

·中药工业·

HPLC法同时测定左归饮提取物中马钱苷和5-羟甲基糠醛的含量

卢春雪，杨绍杰，陶荟竹，黄树明*，杨书彬*

(黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：测定左归饮中马钱苷和5-羟甲基糠醛2种化学成分的含量。方法：采用高相液相色谱法，以C18柱为色谱柱，流动相为乙腈-水，梯度洗脱；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为250 nm。结果：左归饮中的马钱苷和5-羟甲基糠醛分别在0.51～4.08 μg(r=0.999 8)、0.26～2.04 μg(r=0.999 8)与峰面积呈良好线性关系，平均加样回收率分别为101.24%(RSD=1.40%)和99.72%(RSD=1.10%)。结论：该法准确可靠、重复性好，可作为同时测定左归饮中马钱苷和5-羟甲基糠醛含量的测定方法。

左归饮；高效液相色谱法；马钱苷；5-羟甲基糠醛；含量测定

左归饮出自《景岳全书·新方八阵》卷五十一方，是由熟地、山茱萸、枸杞、山药、炙甘草、茯苓6味中药组成的复方，具有滋肾、养肝、益脾的功能。方中重用熟地，甘温滋肾以填真阴；辅以山茱萸、枸杞子养肝血，合主药以加强滋肾阴而养肝血之效；佐以茯苓、炙甘草益气健脾；山药益阴健脾滋肾，是用于补益肾阴、治疗真阴不足之症的经典名方[1]。现代研究证实，该方在治疗肾阴虚型更年期综合征[2]及抗炎、抗衰老[3]等方面有显著疗效，但对于左归饮有效成分及质量控制研究报道较少。研究表明，左归饮君药熟地中的多糖和5-羟甲基糠醛(5-H)等是其药理作用的主要物质基础[4]，《中华人民共和国药典》2015版规定，采用高效液相色谱法测定山茱萸中的指标性化学成分马钱苷的含量[5]，以其作为山茱萸质量控制指标。近代研究发现，山茱萸中的马钱苷能够抗炎，增强免疫，同时可使衰老大鼠红细胞(RBC)中超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量得到恢复[6]，起到抗氧化损伤作用。由于中药复方的有效成分复杂，单一指标对质量控制不够合理。因此，本研究采用HPLC法建立了同时测定左归饮中马钱苷和5-H两种指标性成分含量的方法，为左归饮的质量控制与评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 Separation Module HPLC；Waters 2996 PAD紫外检测器；Millennium32色谱工作站、ME155DU电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；KQ-250E型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

马钱苷对照品(中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-14090413，纯度99.58%)；5-羟甲基糠醛(南京森贝伽生物科技有限公司，批号：67-47-0，纯度98%)；乙腈(色谱纯)；甲醇(天津市天力化学试剂有限公司，分析纯)；水为哇哈哈纯净水。

熟地、山茱萸、枸杞、山药、炙甘草、茯苓6味药材均购自安国市弘发中药材饮片有限公司，经黑龙江中医药大学杨书彬副教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；EasyGurd C18(10 mm×4.0 mm)Kit保护柱；流动相：乙腈-水线性梯度，见表1；流速：1.0 mL·min-1；检测波长为250 nm；进样体积：10 μL；柱温：30 ℃。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品混合溶液的制备 精密秤取马钱苷和5-H对照品适量，采用甲醇配制成每1 mL含马钱苷0.408 mg、5-H 0.204 mg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 据《景岳全书》中左归饮原方的记载，药材按熟地∶山茱萸∶枸杞∶山药∶茯苓∶炙甘草=9∶5∶6∶6∶4∶3的比例，加10倍量蒸馏水先文火烧至水沸腾，后用武火煎煮40 min。纱布过滤，药渣加8倍量蒸馏水先文火后武火沸腾20 min，合并滤液，浓缩后冷冻干燥得冻干粉(出粉率为39.72%)备用。精密秤取左归饮冻干粉0.5 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取40 min，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，5000 r·min-1离心，取上清液，以0.45 μm的微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 参照左归饮处方工艺过程制备缺山茱萸或熟地的阴性样品，按2.2.2项下的供试品制备方法处理，制成缺山茱萸或熟地的阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

将对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液按2.1项下色谱条件进行检测，记录色谱图。在与马钱苷和5-羟甲基糠醛对照品相应的保留时间处没有色谱峰，说明阴性对照溶液无干扰，见图1。

2.4 线性关系考察

将2.2.1项下的混合对照品溶液按梯度稀释成不同浓度，马钱苷质量浓度分别为：0.051、0.102、0.204、0.306、0.408 mg·mL-1；5-羟甲基糠醛质量浓度分别为：0.026、0.051、0.102、0.153、0.204 mg·mL-1，各对照品经0.45 μm的微孔滤膜过滤后，按2.1项下色谱条件进样，记录色谱峰面积，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，对其进行线性回归，得回归方程。结果见表2。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 按2.2项下方法分别制备混合对照品溶液和供试品溶液，在2.1项下色谱条件下连续进样6次。供试品溶液中马钱苷和5-H峰面积的RSD分别为0.39%和0.28%，混合对照品溶液中马钱苷和5-H峰面积的RSD分别为0.48%和0.24%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取同一批样品，照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，进行含量测定。马钱苷和5-H的平均含量分别为0.246%和0.212%，RSD分别为0.73%和0.49%，表明测定方法的重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于配制后0、2、4、8、12、16、24 h进样测定，结果马钱苷和5-H峰面积的RSD分别为0.53%和0.77%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

注：A.混合对照品；B.左归饮供试品；C.缺山茱萸阴性对照；D.缺熟地阴性对照；1.5-羟甲基糠醛；2.马钱苷。图1 混合对照品与左归饮供试品溶液主成分的HPLC图

2.5.4 加样回收率试验 精密称取6份已知含量的同一批次供试品(含马钱苷0.246%、5-H 0.212%)约0.5 g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入用甲醇配制的混合对照品溶液(每1 mL含马钱苷0.408 mg、5-H 0.204 mg)15 mL，甲醇定容至25 mL，按2.1项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表3。

表2 线性关系试验结果

表3 加样回收率试验结果(n=6)

2.6 样品含量测定

参照左归饮处方工艺过程制备3批次样品适量，分别按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，结果见表4。

表4 样品测定结果

3 讨论与小结

3.1 检测波长的选择

为保证各指标成分的测定有较高灵敏度，根据检测器上得到的紫外吸收光谱图辅助成分定性和选择各被测组分的检测波长，马钱苷和5-H在250 nm处都有较大吸收，故选择检测波长分别为250 nm。

3.2 流动相的选择

试验考察了甲醇-水、乙腈-水溶液为流动相的两种洗脱系统，与甲醇相比，相同柱温下乙腈扩散系数小，峰宽较小，分离度R更高，所以以乙腈-水为流动相时，色谱图基线稳定、峰形较好，并且在本研究所采用的梯度下分离效果最好。

3.3 提取条件的选择

试验中比较了回流提取法和超声提取法，结果表明，提取效率相同时，超声提取所用时间较少，且提取操作简单，因此选择超声提取；提取溶剂考察不同浓度甲醇提取效果，结果100%甲醇提取杂质峰较少，被测成分峰面积较大，因此选择100%甲醇提取；比较了超声提取20、30、40、50、60 min的提取效率，结果提取40、50、60 min各被测成分的提取量基本相等，因此选择提取时间40 min。

3.4 小结

左归饮是治疗肾阴虚症的经典方剂，在近年来的临床实验研究中，其在治疗更年期综合征、抗衰老、改善围经期卵巢功能[8-9]方面受到医生和患者的广泛认可。左归饮中水溶性成分包括多糖、马钱苷、5-羟甲基糠醛、梓醇等。本研究建立了左归饮中马钱苷和5-H两种主要成分的综合测定方法，仪器精密度、指标性成分稳定性及方法的重复性和加样回收率等均良好。因此采用本试验方法可为准确对左归饮进行质量控制提供参考，同时也为左归饮中有效成分的继续研究提供依据。

[1] 王燕，董群.左归饮延缓衰老作用研究[J].中药药理与临床，2006，22(3/4)：9-10.

[2] 黄剑英，李晓萍.左归饮合二至丸加减联合西药治疗肾阴虚型更年期综合征临床观察[J].新中医，2015，6(47)：162-163.

[3] 赵薇，温海霞，孙世晓，等.左归饮抗衰老的现代化研究进展[J].中国老年学杂志，2010，9，17(30)：2543-2545.

[4] 李鹏飞，苗明三.熟地黄的现代研究及应用现状分析[J].中医学报，2014，29(2)：252-254.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[6] 宋梅.山茱萸含量测定和药理作用研究进展[J].江苏中医药，2010，9(42)：80-81.

[7] 赵薇，温海霞，郑慧丽，等.左归饮对围绝经期大鼠卵巢P450芳香化酶表达的影响及调节[J].北京中医药大学学报，2010，1(33)：41-46.

[8] 赵薇，温海霞，郑慧丽，等.左归饮对围绝经期大鼠卵巢促卵泡激素受体表达的影响及机制[J].中国中西医结合杂志，2010，3(30)：286-290.

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DeterminationofLoganinand5-hydroxymethylFurfuralinZuoguiDrinkbyHPLC

LUChunxue，YANGShaojie，TAOHuizhu，HUANGShuming*，YANGShubin*

(HeilongjianguniversityofChinesemedicinecollegeofpharmacy.Harbin，Heilongjiang150040，China)

Objective：To determine the content of loganin and 5-hydroxymethyl furfural in Zuogui Drink.Methods：HPLC was performed on C18column using acetonitrile-water as the mobile phase at a flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 250nm.The column temperature was 30 ℃.Results：Loganin and 5-hydroxymethyl furfural showed good linearity in the concentration range of 0.51～4.04 μg (r=0.999 8) and 0.26～2.04 μg(r=0.999 8)，respectively.And their average recovery rates were 101.24% (RSD=1.40%) and 99.72%(RSD=1.10%)，respectively.Conclusion：The method is simple and accurate with good reproducibility.It can be used for the determination of loganin and 5-hydroxymethyl furfural in Zuogui Drink.

Zuogui Drink.；HPLC；loganin；5-hydroxymethyl furfural；content determination

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.025

2015-11-06)

*

杨书彬，副教授，研究方向：中药质量评价及活性研究；Tel:(0451)87266807,E-mail:shubinyang0451@163.com 黄树明，教授，研究方向：中医药防治神经退行性疾病的作用及机制研究；Tel:(0451)87266872，E-mail:huangshuming1958@163.com