百蕊草愈伤组织培养影响因素研究

刘向阳，黄燕芬，王自布，曹永高，罗查梅

(贵州师范学院化学与生命科学学院，贵州贵阳 550018)

Note：Basic culture medium is MS.

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百蕊草愈伤组织培养影响因素研究

刘向阳，黄燕芬*，王自布，曹永高，罗查梅

(贵州师范学院化学与生命科学学院，贵州贵阳 550018)

[目的]对影响百蕊草愈伤组织培养的因素进行研究。[方法]以百蕊草幼嫩枝条和叶片为外植体，研究不同浓度6-BA、NAA、2，4-D或其组合，碳源以及pH等因素对百蕊草愈伤组织生长的影响。[结果]3种植物生长调节剂和碳源对愈伤组织的生长都有促进作用，对愈伤组织诱导生长的培养基最佳组合为MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L，碳源中蔗糖显著促进了百蕊草愈伤组织的增长，以30 g/L的蔗糖为最佳；pH 5.8～6.0有利于愈伤组织的诱导和生长。[结论]该研究为后续研究百蕊草细胞悬浮培养体系的建立提供材料。

百蕊草；愈伤组织；碳源；植物生长调节剂

百蕊草(ThesiumchinenseTurcz.)为檀香科植物，具有重要的药用价值，被称为“植物抗生素”[1]。百蕊草素是其主要成分，已被制成针剂用于治疗多种感染性炎症，具有较好疗效[2]。百蕊草是一种半寄生植物，野生资源较少。近年来，掠夺式的采集使百蕊草资源锐减，已成为频危珍稀种属。为满足市场需求，人工栽培虽然可以减轻供求压力，但由于百蕊草植株较小，产量较低，广种薄收，百蕊草素的生产严重受限。植物组织培养大规模生产植物次生代谢产物，已成为生产某些高价值产品的重要途径。碳源作为细胞的主要能源来源，是组织培养不可缺少的成分，不同的培养细胞适合生长的碳源不同[3]，由于植物组织培养的条件下往往缺乏合成生长素和分裂素的能力，外源激素成为培养基中不可缺少的关键物质[4]；细胞悬浮培养是实现植物细胞工业化生产的途径，相比于固体培养，细胞悬浮培养能使细胞增殖速度加快，可以大规模培养，并能提供大量均匀一致的细胞培养物[5]。笔者通过对百芯草愈伤组织培养的影响因素进行探讨，以期为后续探索百蕊草细胞悬浮培养体系的建立提供材料。1材料与方法1.1材料野生百蕊草植株取自贵州省贵阳市花溪区。外植体为粗细均匀、健壮、无病虫害、无损伤的新生枝条和叶片。1.2方法

1.2.1愈伤组织的诱导培养。外植体经自来水冲洗干净后用0.1%的氯化汞溶液消毒5～8 min，再用无菌水冲洗3次，最后将枝条和叶片剪成约1.0 cm长的小段，接种于表1培养基中。30 d后统计各项数据，筛选最佳初代培养基配方。

表1　单激素愈伤组织诱导培养基配方

注：基本培养基为MS。

Note：Basic culture medium is MS.

1.2.2不同激素配比对愈伤组织诱导的影响。挑选长势较一致的初代诱导愈伤组织，按表2设置不同激素水平的正交试验处理，每处理接种10瓶，每瓶接种相似愈伤组织3块。连续培养30 d后,用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织生长情况。

表2　愈伤组织培养正交试验培养基配方

1.2.3不同碳源对愈伤组织诱导的影响。在上述最佳激素浓度组合培养基中分别附加0、10、20、30、40、50、60 g/L的蔗糖、葡萄糖。每浓度设置10瓶，每瓶接种相似愈伤组织3块，连续培养30 d后，用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织生长情况。

1.2.4不同pH对愈伤组织诱导的影响。挑选长势较一致的初代诱导愈伤组织，以MS为基本培养基，pH设置为5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2，每处理接种10瓶，每瓶接种相似愈伤组织3块。连续培养30 d后，用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织生长情况。

1.2.5愈伤组织继代培养基的选择。将初代培养得到的愈伤组织切成约0.5 cm×0.5 cm的小块，接种至正交试验结果表现较好的C2、C5、C6 3个培养基中继代增殖培养，每处理接种10瓶，每瓶接种3块愈伤组织。连续培养30 d后，用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织增殖、生长情况。

1.3培养条件 培养室温度(24±3)℃，光照时间10～12 h/d，光照强度1 500～1 800 lx。

2　结果与分析

2.1不同激素对愈伤组织生长的影响外植体接种14 d后腋芽开始萌动，切口处开始膨大形成愈伤组织。培养30 d时的生长情况见表3。由表3可知，随着激素浓度的增加，愈伤组织不断增长，生长量和增殖率都有一定的提高，当6-BA、NAA、2，4-D浓度分别添加至1.00、0.15，0.10 mg/L时，愈伤组织的生长量、增殖率达到最大，愈伤组织呈深绿色。随着培养时间的延长，愈伤组织的颜色渐变为浅绿色。当6-BA、NAA、2，4-D浓度分别为3.00、2.00、0.25 mg/L时，愈伤组织生长缓慢，且随着培养时间的延长发生褐变，颜色渐变为黄色，最终导致愈伤组织死亡。

2.2激素配比对愈伤组织生长的影响由表5可知，C2、C5和C6诱导出愈伤组织的数量比其他处理理想。三者中C2处理相比C5和C6处理诱导愈伤组织的效果好，C6有少量苗出现。

表3　不同激素对愈伤组织生长的影响

注：基本培养基为MS。

Note：Basic culture medium is MS.

表4　不同激素配比对愈伤组织生长的影响

注：基本培养基为MS。

Note：Basic culture medium is MS.

表5　碳源对愈伤组织生长的影响

注：基本培养基为MS。

Note：Basic culture medium is MS.

2.3不同碳源对愈伤组织生长的影响由表5可知，随着碳源浓度的增加，愈伤组织生长量都有不同程度的增加，碳源浓度从0提高到30 g/L时，愈伤组织生长量也增加，30 g/L时达到最大，愈伤组织呈深绿色，随着培养时间的延长，愈伤组织的颜色渐变为健康的浅绿色。当碳源浓度从30 g/L增加到60 g/L时，愈伤组织的生长量随着碳源浓度的增加而逐渐下降，生长缓慢，并随着培养时间的延长发生褐变，最终导致愈伤组织死亡。蔗糖为碳源时，愈伤组织的生长量、增殖率比葡萄糖均有一定的提高。综上所述，蔗糖和葡萄糖作为碳源都能影响愈伤组织的生长，随着碳源浓度的增加，愈伤组织都有不同程度的增长，蔗糖作用显著优于葡萄糖，且蔗糖价格低廉，有利于降低培养成本。

2.4不同pH对愈伤组织生长的影响pH为5.8～6.0时愈伤组织长势较好，增长较快，颜色为健康的浅绿色，其他pH下愈伤组织生长缓慢，随着培养时间的延长发生褐变，颜色渐变为黄色，最终导致愈伤组织死亡。说明pH过低或过高不适合愈伤组织培养，pH 5.8～6.0最为适宜。

表6　愈伤组织继代培养基的选择

注：基本培养基为MS。

Note：Basic culture medium is MS.

2.5愈伤组织继代培养基的选择由表6可知，不同处理愈伤组织的增长和分化程度不同。C2处理愈伤组织的分化较好，生长量和增殖率比其他2个处理高，且愈伤组织随着培养时间的延长基本未发生褐变，颜色为浅绿色，较健康；C5处理愈伤组织褐化程度比C2和C6处理严重，生长量和增殖率比C6处理理想，C6处理未出现严重的褐化，但愈伤组织分化生长不理想，且易分化出苗。综合各项指标，以C2处理MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L最佳。

3　结论

该试验结果表明，3种激素和碳源对愈伤组织生长均有促进作用，对愈伤组织诱导生长的培养基最佳组合为MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L。碳源中蔗糖显著促进百蕊草愈伤组织的增长，以30 m/L的蔗糖为最佳；pH 5.8～6.0有利于愈伤组织的诱导和生长。

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会．中华本草[M]．上海：上海科学技术出版社，1999：595-597.

[2] 安徽省百蕊草研究协作小组.百蕊草治疗急性炎症疾患的临床观察[J].新医药学杂志，1972(2)：38-39.

[3] SMITH M A L，MADHAVI D L，FANG Y，et al.Continuous cell cultureand product recovery from wildVacciniumpahalaegemplasm[J].Journal of plant physiology，1997，150(4)：462-466.

[4] 李代丽.白刺愈伤组织培养中外源激素对内源激素影响的研究[D]．北京：北京林业大学，2007

[5] 张韧，秦玉明，陈文庆，等．悬浮培养技术在生物制药中的应用和展望[J]．中国兽药杂志， 2011，45(3)：56-60.

[6] 颜敬昌.植物组织培养手册[M].上海：上海科学技术出版社，1999：63-67.

Study on the Influencing Factors of Callus Culture ofThesiumchineseTurcz.

LIU Xiang-yang, HUANG Yan-fen*, WANG Zi-buet al

(School of Chemistry and Life Sciences,Guizhou Education University, Guiyang,Guizhou 550018)

[Objective]The aim was tostudy factors influencing callus culture ofThesiumchinense.[Method] Taking tender branches and leaves ofT.chinenseas explants, effects of different concentrations of 6-BA, NAA, 2,4-Dand their combinations,carbon soueces as well as pH on callus were investigatedby using the orthogonal experiments.[Result] The results showed that fitting concentration of plant growth regulators and carbon sources could all promote the growth of callus,the best medium for induction of callus is MS+mediumsupplemented with 6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L, in the carbon sources,sucrose markedly increased callus, the adding of 30 m/L sucrose was the best choice.The pH value was 5.8-6.0.[Conclusion] The study can provide materials for study onT.chinensecell suspension culture.

ThesiumchinenseTurcz.; Callus; carbon sources; Plant growth regulators

贵州省高等学校大学生创新创业训练计划项目(黔教办高〔2014〕321号)；贵州省教育厅自然科学研究招标项目(黔教合KY字[2015]358)。

刘向阳(1993- )，男，贵州罗甸人，本科生，专业：生物科学。*通讯作者，教授，从事植物组织培养技术研究。

2016-06-12

S 188

A

0517-6611(2016)22-132-03