不同提取方法对荔枝干粗多糖提取率及其自由基清除活性的影响

彭 刚， 陈梓欣， 张晓辉， 黄略略， 张树飞， 乔 方

(深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院，广东深圳 518055)



不同提取方法对荔枝干粗多糖提取率及其自由基清除活性的影响

彭 刚， 陈梓欣， 张晓辉， 黄略略， 张树飞， 乔 方*

(深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院，广东深圳 518055)

[目的]通过比较提取率和抗氧化活性，从3种多糖提取方法中筛选出适合荔枝干多糖的提取方法。[方法]优化热水浴、微波超声协同和纤维素酶活法各提取参数条件，比较三者在多糖得率、含量以及对ATBS和DPPH自由基清除方面的差异。[结果]热水浴法多糖提取率随温度升高而逐渐增加，但温度较高时其升幅降低；微波超声协同法液料比变化对提取率有影响，但提升幅度较小；纤维素酶活法也存在类似现象。在最优条件下纤维素酶活法具有最低的提取率和最高的多糖比率。另外，纤维素酶提取法所得多糖清除ATBS自由基能力较强，其次为热水浴法，最后为微波超声协同法。[结论]热水浴法具有提取率高、操作简便、多糖含量和抗氧化活性较高等优势，更适合于荔枝干多糖的提取。

荔枝干；多糖；抗氧化活性；提取率

荔枝(LitchichinensisSonn)属于无患子科荔枝属植物，原产我国，目前在亚洲东南部、非洲、美洲、大洋洲均有广泛栽培[1]。作为岭南特色热带水果，荔枝在我国已有两千多年的种植历史。荔枝鲜果采收期短，且不易保存，常被制成荔枝干，以保证市场周年供应。《本草纲目》记载：“常食荔枝，能补脑健身，治疗瘴疠疗肿，开胃益脾；干制品能补元气，为产妇及老弱补品[2]。”研究表明，荔枝干果肉中主要活性成分为多糖，该成分具有降血压、降血糖、抗疲劳、提高免疫力等功效[3]。

为了更好地研究荔枝干多糖，其成分提取是关键的一步。传统植物多糖提取常采用热水浴法，该方法具有操作简便、使用仪器少等特点。但随着科学技术手段的增加，新的提取工艺也在不断涌现，如纤维素酶活法、微波超声协同提取法[4]。这些方法均具有各自的优缺点，但是否适用于荔枝干多糖提取，有待进一步研究。笔者采用3种多糖提取方法提取荔枝干多糖，比较3种方法在多糖提取率、多糖含量以及所提多糖抗氧化活性方面的差异，筛选出适合荔枝干多糖的提取方法，以期为进一步研究荔枝干多糖功能奠定基础。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1原料及试剂。荔枝干购于深圳市南山区西丽果场。乙醇、甲醇、浓硫酸、葡萄糖购自广州化学试剂厂。纤维素酶和抗坏血酸购自广州健阳生物科技有限公司。考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白标准品、DPPH和ATBS均购自于Sigma公司；试验所用试剂均为分析纯。

1.1.2主要仪器。TM-767专业冰沙搅拌机，DK-20水浴磁力搅拌器，CW-2000超声微波协同萃取仪，L6紫外-可见分光光度计，5810R高速冷冻离心机，Enspire Xenon Light Module多功能酶标仪，Seven Multi多功能pH计。

1.2方法

1.2.1荔枝干粉制备。将购买的妃子笑荔枝干去除果皮和种子后，称取500 g放入冰沙搅拌机中，并加入500 mL 80%的乙醇溶液，开机搅拌2 min；将匀浆液倒入已铺设2层纱布的漏斗中进行过滤，并不断用钥匙搅拌以加快过滤过程；待滤液流尽后，再次将滤渣与500 mL 80%的乙醇溶液混合搅拌，过滤，完后再重复1次；所获得滤渣在50 ℃下烘干，打粉备用。

1.2.2传统热水浴提取荔枝干多糖。称取1 g左右荔枝干粉末，按10∶ 1、20∶1、30∶1的液料比加入纯水(pH 7.5)；放入磁力转子，分别置于60、80和100 ℃的热水浴中搅拌2 h；待冷却至室温后，在4 ℃、10 000 r/min 离心10 min；最后量取上清液，并加入3倍体积的无水乙醇，混匀后4 ℃沉淀过夜，次日离心后，沉淀即为荔枝干粗多糖[5]。多糖提取率公式参照张钟等[6]的方法。

1.2.3纤维素酶活法提取荔枝干多糖。参考Zhang等[5]的方法并进行调整，具体步骤：称取1 g荔枝干粉末，并按物料比0.5%、1.0%、1.5%加入相应量的纤维素酶粉，再按10∶1、20∶1、30∶1的比例加入pH 4.8的水溶液；随后将溶液与粉末混匀后，加入磁力转子，在50 ℃下水浴反应2 h；最后按照热水浴法离心、沉淀多糖。1.2.4微波超声协同法提取荔枝干多糖。称取1 g荔枝干粉末，按10∶1、20∶1、30∶1的液料比加入纯水，装入特制的超声瓶中，放入超声微波协同萃取仪；设置温度上限为50 ℃，并调整微波功率从100～300 W，反应30 min；完成后，取出反应溶液，离心取上清，其余步骤采用热水浴法提取和沉淀多糖[5]。1.2.5荔枝干多糖含量测定。参照姜琼等[7]的苯酚-硫酸法制作葡萄糖标准曲线和测定多糖含量。多糖比率计算公式参照张钟等[6]的方法。

1.2.6荔枝干粗多糖DPPH抗氧化活性测定。参照Zhang等[8]的方法，以抗坏血酸为标准物。

1.2.7荔枝干粗多糖ATBS抗氧化活性测定。参照Re等[9]的方法，以抗坏血酸为标准物。

2　结果与分析

2.1不同参数条件下传统热水浴法对荔枝干多糖提取的影响由表1可知，在一定提取温度范围内(60～80 ℃)，随着温度的升高，多糖提取率从4.3%升高到10.0%左右。但随着温度的进一步升高(80～100 ℃)，多糖提取率则呈平稳或略有降低的趋势。这表明温度过高反而抑制荔枝干粗多糖提取率的上升。类似现象在其他材料上均有发现[10-11]。因此，热水浴最优温度应在80 ℃左右，而此时荔枝干多糖提取率约为10%。在相同温度(80 ℃)下，随着液料比的增加多糖提取率升高。但在高温条件下(80 ℃以上)，液料比为30∶1～20∶ 1多糖提取率差异不显著，且提取液的增加反而加大了后续操作难度。因此，液料比一般控制在30∶1和20∶1为宜。在多糖比率方面，无论是温度还是液料比的改变并未使得多糖比率呈明显规律性变化，基本维持在37.0%～44.4%。

表1不同条件下热水浴法对荔枝干粗多糖提取效率的影响

Table 1The effect of different hot-water extraction parameters on dry litchi polysaccharide extraction

提取温度Extractiontemperature∥℃液料比Liquid-solidratio提取率Extractionrate∥%多糖比率Polysaccharideratio∥%6010∶14.3±0.4643.26020∶16.6±0.4437.46030∶17.8±0.4041.48010∶17.7±0.4240.68020∶19.6±0.5137.08030∶110.1±0.0342.510010∶16.6±0.9644.410020∶18.1±0.7737.810030∶110.2±0.5041.8

2.2不同参数条件下微波超声协同法对荔枝干多糖提取的影响由表2可知，在微波超声协同提取荔枝干粗多糖过程中，随着微波功率的增加，多糖提取率略有降低，但基本保持在8.1%～10.3%。但液料比的增加，总体小幅度提高了多糖提取率。在多糖比率方面，在相同微波功率条件下，随着液料比中提取液含量的增加，多糖比率呈上升趋势，基本维持在35.6%～46.3%。而在相同液料比条件下，微波功率变化对多糖比率的影响不存在明显规律。在相同超声功率条件下，当微波功率高于200 W时多糖提取率下降[12-13]。另外，在微波功率高于200 W时，随着液料比的增加，多糖提取率呈小幅上升趋势。这与关于金针菇方面的试验结果相近[14]。

表2不同条件下微波超声协同法对荔枝干粗多糖提取效率的影响

Table 2The effect of different microwave-ultrasounic coordination extraction parameters on dry litchi polysaccharide extraction

微波功率Microwavepower∥W液料比Liquid-solidratio提取率Extractionrate∥%多糖比率Polysaccharideratio∥%10020∶19.0±0.2140.310030∶19.1±0.1742.110040∶18.8±0.3741.320020∶18.1±0.1230.020030∶19.1±0.3535.720040∶19.2±0.1143.230020∶17.5±0.2135.630030∶18.5±0.3338.330040∶110.3±0.1846.3

2.3不同参数条件下纤维素酶活法对荔枝干多糖提取的影响由表3可知，在相同液料比条件下，不同酶用量对荔枝干粗多糖提取率影响不明显。但在相同酶用量条件下，随着液料比的增加，多糖提取率从2.5%逐渐升高到4.2%。但在不同条件下，多糖比率基本保持在48%～50%。提取过程中，纤维素酶用量在0.5%～1.5%，多糖比率总体呈上升趋势，但不同处理之间差异不显著[15]。而相同酶用量条件下，液料比的改变则使得多糖提取率小幅提升，小于1%。这与纤维素酶法提取金钗石斛多糖结果相近，即液料比对提取率有影响，但提升幅度较小[16]。

表3不同条件下纤维素酶活法对荔枝干粗多糖提取效率的影响

Table 3The effect of different cellulose extraction parameters on dry litchi polysaccharide extraction

酶用量Enzymedosage∥%液料比Liquid-solidratio提取率Extractionrate∥%多糖比率Polysaccharideratio∥%0.510∶12.1±0.2951.00.520∶13.3±0.1746.80.530∶13.3±0.0857.71.010∶12.0±0.3344.31.020∶13.3±0.0948.61.030∶13.2±0.1659.61.510∶12.5±0.0553.61.520∶13.6±0.1051.01.530∶14.2±0.1756.8

2.4不同提取方法所得粗多糖的抗氧化活性差异由图1可知，作为标准物，维生素C无论对ATBS自由基还是DPPH自由基均具有较强的自由基清除能力，其IC50分别为47.2和23.5 μg/mL。热水浴法所提粗多糖在清除ATBS和DPPH自由基方面均明显低于纤维素酶活提取法。在ATBS自由基清除能力方面，热水浴法所提多糖IC50为214.2 μg/mL；纤维素酶活法IC50为196.7 μg/mL。而清除DPPH自由基时，二者IC50分别为139.2、123.7 μg/mL。但微波超声协同法所提多糖对不同自由基清除能力存在差异。其对ATBS自由基清除能力较弱(IC50=267.3 μg/mL)，而对DPPH自由基清除能力较强(IC50=100.8 μg/mL)。这可能是由于超声处理易导致多糖长链分子断裂，从而提高了其对DPPH自由基清除能力[17-18]。

图1　不同提取方法所得多糖对ATBS(A)和DPPH(B)自由基清除能力Fig.1　The ATBS (A) and DPPH (B) free radical scavenge capacity of polysaccharides from different extraction methods

3　结论与讨论

该研究对荔枝干多糖不同提取方法的参数进行优化，结果表明，传统热水浴法：提取温度80 ℃，液料比20∶1，多糖提取率为10%；超声微波辅助法：功率200 W，液料比30∶1，多糖提取率为9.1%;纤维素酶活法：酶量1.0%，液料30∶1，多糖提取率为3.2%。比较3种方法所得荔枝干粗多糖在DPPH和ATBS自由基清除能力方面的差异，结果表明，微波超声协同法所得多糖活性较低，热水浴与纤维素酶活法所得多糖活性相近。综合考虑多糖提取率和活性指标，传统热水浴法更适合荔枝干多糖的提取。

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Effect of Different Extraction Methods on the Extraction Rate and Free Radical Scavenging Capacity of Dry Litchi Crude Polysaccharide

PENG Gang, CHEN Zi-xin, ZHANG Xiao-hui, QIAO Fang*et al

(School of Applied Chemistry and Biological Technology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518055)

[Objective] In order to screen an extraction method for dry litchi, three different polysaccharide extraction methods were compared with their extraction rate and antioxidant activity.[Method] The parameters of conventional hot water, microwave-ultrasounic coordination and cellulose methods were optimized to reach optimal yield.Then the crude polysaccharide, polysaccharide content and their DPPH and ATBS scavenging capacity were compared.[Result] In conventional hot water method, the extraction rate was increased with the improvement of temperature.But at the high temperature stage, the increase was limited; in microwave-ultrasonic coordination method, the change ratio of liquid to material also had effect on extraction rate; the similar phenomenon was also found in cellulose method, which had the lowest extraction rate, but the highest polysaccharide rate.The antioxidant activity test showed that the polysaccharide from cellulose extraction method had the strongest ATBS free radical scavenging activity, then the conventional hot water and microwave-ultrasonic coordination method.But a little difference was found in DPPH test, due to the increase activity from microwave-ultrasonic coordination method.[Conclusion] Due to the highest extraction rate, easy operation, higher polysaccharide content and antioxidant activity, the conventional hot water method was fit to dry litchi polysaccharide extraction.

Dry litchi; Polysaccharides; Antioxidant activity; Extraction rate

深圳市科技计划项目(JCYJ20140508155916427)；现代农业产业技术体系建设专项(CARS-33-20)。

彭刚(1983-)，男，四川宜宾人，助理研究员，博士，从事植物生物活性物质提取及开发方面的研究。*通讯作者，教授，博士，从事食品功能性开发研究。

2016-06-22

S 667.1

A

0517-6611(2016)22-098-03