黄芪甲苷提取方法优化

李焕娟， 张 聪， 郝 洁

(国家兽用药品工程技术研究中心/洛阳惠中兽药有限公司，河南洛阳 471000)



黄芪甲苷提取方法优化

李焕娟， 张 聪， 郝 洁

(国家兽用药品工程技术研究中心/洛阳惠中兽药有限公司，河南洛阳 471000)

[目的]优化黄芪药材中黄芪甲苷提取方法。[方法]采用单因素试验对提取方式、提取溶剂、提取次数进行考察，采用HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷含量。[结果]黄芪药材中黄芪甲苷最优提取方法为每次用50倍的50%甲醇加热回流提取2次，每次1 h。[结论]该试验所建立的方法操作简单、准确可靠、重现性好，为黄芪饮片及制剂中黄芪甲苷的提取及含量测定提供参考。

黄芪；黄芪甲苷；提取方法；优化

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。黄芪甲苷是黄芪药材及其制剂质量控制的重要指标[2]。研究发现，黄芪药材中以原形形式存在的黄芪甲苷含量很低，在对其进行制剂研究时，以黄芪甲苷为母核的皂苷类成分极易转化成黄芪甲苷[3]。另外，由于药材的处理方法不同，所测得的黄芪甲苷含量也有很大的不同。《中国药典》2010年版所用样品前处理方法耗时较长，测得含量偏低[4]。一些学者对黄芪中黄芪甲苷的提取方法进行了研究，但结果仍不太理想[5-7]。该研究采用单因素试验对提取方式、提取溶剂、提取次数进行考察，优化黄芪药材中黄芪甲苷提取方法，并采用HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷含量，为黄芪药材及制剂中黄芪甲苷的检测提供科学依据。

1　 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器。Waters高效液相色谱仪(型号Alliance e2695)、蒸发光散射检测器(型号2424)，美国沃特世公司；Kromasil 100-5C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，瑞典NOBEL公司；AB265-S型电子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；HH-WO型智能数显多功能水浴锅、SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵，巩义予华仪器有限责任公司；JK-3200B型超声清洗器，合肥金尼克机械制造有限公司；TQ-2000Y型高速多功能粉碎机，永康市天祺盛世工贸有限公司。

1.1.2试药。3批黄芪饮片，购自洛阳康鑫中药饮片有限公司，产地及批号分别为山西20140421、河北20140912、山西20150416；黄芪甲苷对照品(批号110781-200613，含量100%)，中国食品药品检定研究院；正丁醇(AR，批号20140916)、甲醇(AR，批号20150605)，天津富宇精细化学品有限公司；氨水(AR，批号20140306)，烟台市双双化工有限公司；乙腈(色谱纯，批号151124)，天津市四友精细化学品有限公司；水为纯化水和超纯水，自制。

1.2方法

1.2.1对照品溶液的制备。精密称取黄芪甲苷10.79 mg，置25 mL量瓶，甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.2.2供试品溶液的制备。

1.2.2.1提取方式考察。

(1)索氏提取。取黄芪中粉约2 g，精密称定，置索氏提取器中，加100 mL甲醇，加热回流4 h，提取液减压回收溶剂至干，残渣加10 mL水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次40 mL，弃去洗液，正丁醇液蒸干，残渣用适量甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[1]。

(2)回流提取。取黄芪中粉约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加100 mL甲醇加热回流1 h，抽滤，滤渣和滤饼加入100 mL甲醇加热回流1 h，共提取2次，合并滤液，减压回收溶剂至干，残渣加10 mL水溶解，其余步骤同“1.2.2.1”中索氏提取。

(3)超声提取。取黄芪中粉约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加100 mL甲醇超声1 h，抽滤，滤渣和滤饼加入100 mL甲醇超声1 h，共提取2次，合并滤液，减压回收溶剂至干，残渣加10 mL水溶解，其余步骤同“1.2.2.1”中索氏提取。

1.2.2.2提取溶剂考察。取黄芪中粉约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加100 mL甲醇、100 mL水、100 mL 50%甲醇加热回流1 h，抽滤，滤渣和滤饼分别加100 mL甲醇、100 mL水、100 mL 50%甲醇加热回流1 h，共提取2次，合并滤液，减压回收溶剂至干，残渣加10 mL水溶解，其余步骤同“1.2.2.1”中索氏提取。

1.2.2.3提取次数考察。取黄芪中粉约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加100 mL 50%甲醇，加热回流1 h，每个样品分别共提取1、2、3次，抽滤，分别合并滤液，减压回收溶剂至干，残渣加10 mL水溶解，其余步骤同“1.2.2.1”中索氏提取。

1.2.2.4供试品溶液的制备。取黄芪中粉2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加100 mL 最优溶剂采用最优提取方式提取1 h，抽滤，滤渣和滤饼加入100 mL 最优溶剂采用最优提取方式提取1 h，共提取最优次数，合并滤液，减压回收溶剂至干，残渣加10 mL水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次40 mL，弃去洗液，正丁醇液蒸干，残渣用适量甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.2.3色谱分析条件。色谱柱为Kromasil 100-5C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，流动相为乙腈-水(35∶65)，柱温30 ℃，Waters 2424 ELSD检测条件，增益50 LSU，漂移管温度60 ℃，氮气压力25 Psi，雾化器温度36 ℃。

1.2.4方法学考察。

1.2.4.1线性关系的考察。分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液3、5、8、10和15 μL注入液相色谱仪，以对照品峰面积对数(y)为纵坐标、进样量对数(x)为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程。

1.2.4.2 精密度试验。按“1.2.2”方法制备供试品溶液，连续进样6次，每次进样10 μL，测得黄芪甲苷峰面积，计算RSD值，要求该值小于3%。

1.2.4.3 稳定性试验。取“1.2.2”方法制备供试品溶液，于室温下放置，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，每次进样10 μL，测得黄芪甲苷峰面积，计算RSD值，要求该值小于3%。

1.2.4.4重复性试验。取同一黄芪中粉2 g，按“1.2.2”方法平行制备供试品溶液6份，每次进样10 μL，测得黄芪甲苷含量，计算RSD值，要求该值小于3%。

1.2.4.5加样回收率试验。取已知含量的同一黄芪中粉1 g，精密称定，加入黄芪甲苷对照品溶液(0.431 6 mg/mL)5 mL，平行6份，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，进样10 μL，测得黄芪甲苷含量，计算加样回收率和RSD。

1.2.5样品含量测定。取市售3批黄芪药材样品，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，按照“1.2.3”色谱分析条件，测定黄芪甲苷的峰面积，计算含量。

2　 结果与分析

2.1供试品溶液的制备方法按“1.2.2.1”方法操作，结果显示，索氏提取、回流提取和超声提取测得黄芪甲苷含量分别为0.178%、0.180%和0.159%，表明回流提取所得黄芪甲苷含量较高。按“1.2.2.2”方法操作，100 mL甲醇、100 mL水和100 mL 50%甲醇作为溶剂进行加热回流提取，测得黄芪甲苷含量分别为0.179%、0.203%和0.236%，表明提取溶剂为50%甲醇时所得黄芪甲苷含量较高。按“1.2.2.3”方法操作，结果显示，提取次数分别为1、2和3次所测得黄芪甲苷含量分别为0.197%、0.242%和0.235%，表明提取2次即可将黄芪中的黄芪甲苷提取完全。由此可见，黄芪药材中黄芪甲苷最优提取方法为每次用50倍的50%甲醇加热回流提取2次，每次1 h。

2.2色谱条件及系统适应性试验从图1可以看出，在相同的色谱条件下，供试品与对照品在相同的保留时间(7.7 min)出峰，且分离度较大，说明此条件适合该样品测定黄芪甲苷。

图1　供试品溶液(a)和对照品溶液(b)的HPLC图谱Fig. 1　HPLC of tested solution (a) and reference solution (b)

2.3方法学考察

2.3.1线性关系的考察。以对照品峰面积对数(y)为纵坐标、进样量对数(x)为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程为Y=1.571 9x+5.407 9(r=0.999 5)，表明黄芪甲苷进样量在1.26～6.31 μg范围内进样量对数与峰面积对数呈良好的线性关系。

2.3.2精密度试验。按“1.2.4.2”方法操作，计算得峰面积的RSD为1.3%，表明精密度良好。

2.3.3稳定性试验。按“1.2.4.3”方法操作，计算得峰面积的RSD为2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4重复性试验。按“1.2.4.4”方法操作，计算得平均含量为0.242%，RSD为2.1%，表明重复性良好。

2.3.5加样回收率试验。由表1可见，平均回收率为99.4%，RSD为2.2%，表明该方法准确、可靠，可用于黄芪药材中黄芪甲苷的含量测定。

表1　加样回收率试验结果

2.4样品含量测定方法确定并验证后，取市售3批黄芪药材样品进行药材中的黄芪甲苷含量测定。由表2可见，3批黄芪药材中黄芪甲苷含量分别为0.242%、0.118%和0.209%，其含量均远大于《中国药典》2010年版中黄芪药材中的黄芪甲苷含量标准(0.040%)。

表2　3批样品含量测定结果(n=3)

3　小结

(1)通过对提取方式、提取溶剂、提取次数3个因素进行考察，黄芪药材中黄芪甲苷最优提取方法为每次用50倍的50%甲醇加热回流提取2次，每次1 h。

(2)与《中国药典》2010年版相比，改进后的方法，简化了样品的制备过程，简便、省时，可作为黄芪药材及其制剂中黄芪甲苷的检测方法。该试验采用的方法测得黄芪甲苷的含量高于药典方法，若以此法测定黄芪中黄芪甲苷的含量，其含量限度的制订尚待进一步深入研究。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:中国医药科技出版社, 2010:283-284.

[2] 段立军,孙博航.黄芪甲苷的研究进展[J].沈阳药科大学学报,2011,28 (5):410-416.

[3] 王春怡,叶雪兰,李卫民,等.黄芪总皂苷提取物的质量标准研究[J].时珍国医国药, 2012,23(1):94-96.

[4] 潘细贵,汪洋,雷湘,等.大孔吸附树脂纯化黄芪总皂昔的提取工艺研究[J].中国医院药学杂志, 2005,25(11):1029-1030.

[5] 刘浩文,刘嘉仪,杨妙荣,等.黄芪药材中黄芪甲苷含量测定的两种方法的比较研究[J].中药新药与临床药理,2011,22(6):659-662.

[6]丁如贤,李霞,李一珺,等.黄芪药材、饮片中黄芪甲苷含量测定方法的改进[J].世界中医药,2013,8(6):669-671.

[7] 姜丽丽,张传领,苏丽娟,等.HPLC-UV法测定黄芪干燥根中黄芪甲苷的含量[J].安徽农业科学,2014,42(22):7381-7383.

Improvement in Extraction Method of Astragaloside IV

LI Huan-juan, ZHANG Cong, HAO Jie

(National Research Center for Veterinary Medicine / Luoyang Huizhong Animal Medicine Co. , Ltd., Luoyang, Henan 471000)

[Objective] The aim was to improve the extraction method of astragaloside IV from Astragali Radix. [Method] Three factors including extraction method, extraction solvent and extraction times were studied through single-factor test. HPLC-ELSD method was adopted to analyze the determination results of astragaloside IV. [Result] The best extraction method of astragaloside IV in Astragali Radix was as follows: 50 times of 50% methanol was added, heated reflux extraction was adopted for two times with 1 hours for each extraction. [Conclusion] The improved method is simple, accurate and reproducible, which can supply a reference for extraction and determination of Astragali Radix.

Astragali Radix; Astragaloside IV; Extraction method; Optimization

李焕娟(1989- )，女，河南平顶山人，硕士，从事中药制剂工艺研究。

2016-06-24

S 567

A

0517-6611(2016)22-125-03