燕窝提取物抗H5N1禽流感病毒的作用及机理研究

林洁茹，张莹，戴卫平，刘叔文，李耿，周华，赖小平

（1.广州中医药大学中药学院，广东广州　510006；2.南方医科大学药学院，广东广州　510515；3.澳门科技大学，澳门）

燕窝提取物抗H5N1禽流感病毒的作用及机理研究

林洁茹1，张莹1，戴卫平1，刘叔文2，李耿1，周华3，赖小平1

（1.广州中医药大学中药学院，广东广州510006；2.南方医科大学药学院，广东广州510515；3.澳门科技大学，澳门）

【目的】观察燕窝提取物体外抑制H5N1禽流感病毒的作用。【方法】制备燕窝水提物、燕窝水提物人工胃液消化物、燕窝水提物人工肠液消化物。通过体外293T细胞转染方法，应用荧光素酶检测试剂盒检测3种燕窝提取物对H5N1禽流感假病毒、VSV-G假病毒活性的影响；观察禽流感病毒H5、H7、H9 3种亚型抗原凝血反应及3种燕窝提取物对其抑制作用；应用神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒检测3种燕窝提取物对N1型神经氨酸酶（NA）活性的影响。【结果】3种燕窝提取物对H5N1禽流感假病毒活性均有抑制作用，抑制作用的强度随燕窝提取物浓度增高而增加，其中人工肠液消化物作用最强，水提取物最弱，但对VSV-G假病毒活性均无显著抑制作用。H5、H7型抗原凝血价为1∶128，H9型抗原凝血价为1∶256，3种燕窝提取物在一定浓度条件下对H5、H7、H9抗原血凝反应均有抑制作用，但对NA均没有抑制作用。【结论】燕窝提取物抗病毒的作用可能是通过抑制血凝素的活性而实现的。

燕窝提取物/药理学；H5N1禽流感病毒；细胞转染；凝血反应

燕窝是一种名贵的中药材，具有润肺滋阴、化痰止咳、益气补中的功效［1］，阐明燕窝的生物活性具有重要的意义。燕窝含大量唾液酸。研究［2］表明，唾液酸及其衍生物在抗流感病毒、轮状病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等方面有重要作用。可见，燕窝抗病毒作用是值得深入研究的方向。H5N1高致病性禽流感是人、禽和其他哺乳动物共患的一种传染病，发病人群年龄偏低、病死率高［3］。本研究因此以H5N1禽流感病毒为研究对象，观察燕窝提取物体外对H5N1病毒的抑制作用，为进一步评价燕窝的价值和功效、产品研发和代用品研究提供参考，现将研究结果报道如下。

1　材料与方法

1.1实验药物印度尼西亚白燕窝，由新加坡锦兴公司提供，经广州中医药大学赖小平教授采用传统性状鉴定方法鉴定为中药燕窝。

1.2细胞株人肾上皮细胞系293T细胞，由南方医科大学药学院馈赠。

1.3主要仪器与试剂5810R台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Infinite M200 Pro多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；HH-2恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）；DYCZ-24DN垂直电泳仪、Moder GS-800光密度扫描仪（美国Bio-Rad公司）。胃蛋白酶（美国Amreseo公司，批号：2588B243）；胰蛋白酶（美国Life Technologies公司，生产批号：1732496）；细胞裂解液（美国Promega公司，批号：E1531）；荧光素酶检测试剂盒（美国Promega公司）；神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；H5、H7、H9禽流感病毒3种亚型血凝抗原由南方医科大学药学院馈赠。

1.4质粒pHA-H5质粒、pNA-Nl质粒、pVSVG质粒、pNL4-3.Luc.R-E-质粒由南方医科大学药学院馈赠。①pHA-H5和pNA-N1质粒：是在pCMV质粒基础上构建表达血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的质粒，其中HA和NA为H5N1的基因序列。2个质粒分别用RT-PCR获得H5N1的HA 和NA的cDNA，经双酶切后定向克隆到pCMV真核表达载体，并经DNA序列分析鉴定，确认序列正确。②PNL4-3.Luc.R-E-质粒：是1个表达荧光素酶（luciferase），且存在Vpr基因缺陷（R-）和包膜蛋白缺陷（E-）的HIV质粒。PNL4-3是具有HIV全长序列，可以复制和感染的嵌合体DNA。PNL4-3.Luc.R-E-是由PNL4-3改造而来的，对PNL4-3的HIV的Vpr基因和Env（包膜蛋白）基因的阅读框架移位，使其不表达这两个蛋白，丧失了感染性。Vpr基因表达的蛋白称为病毒蛋白R，其介导HIV的基因进入细胞核进行基因整合，R的缺失保证了假病毒的安全性。同时，PNL4-3的Nef基因上插入了荧光素酶基因，使其能用Promega的荧光素酶试剂盒对病毒进行定量检测。PNL4-3.Luc.R-E-需要与表达包膜蛋白的质粒共转染293T细胞才可以产生假病毒。

1.5样品制备

1.5.1燕窝水提物制备（编号：A）取燕窝粉末适量，加300 mL双蒸水室温浸泡2 h，80℃提取l h，4℃放置备用。

1.5.2燕窝水提物人工胃液消化物的制备（编号：B）人工胃液配制：NaCl 2.0 g，胃蛋白酶3.2 g，浓盐酸7 mL，双蒸水定容1 000 mL，pH为1.2。取1 支1.5 mL灭菌离心管，加入2×人工胃液100 μL，37℃保温10 min。然后加入样品A 100 μL（37℃预热），37℃消化1 min，加入0.168 mol/L Na2CO3调整pH值为7～8以终止反应。

1.5.3燕窝水提物人工肠液消化物的制备（编号：C）人工肠液配制：将KH2PO46.8 g溶于250 mL双蒸水，振荡，完全溶解后加190 mL 0.2 mol/L NaOH 和400 mL双蒸水。加胰蛋白酶10.0 g，混匀，用0.2 mol/L NaOH调pH到7.5，双蒸水定容于1 000 mL。取1支1.5 mL灭菌离心管，加入2×人工肠液100 μL，37℃保温10 min。然后加入样品A 100 μL（37℃预热），37℃消化1 min，90℃加热5 min以终止反应。

燕窝A、B、C用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，母液为10 mg/mL，在做假病毒实验时用完全培养基（体积分数90%DMEM+体积分数10%胎牛血清+体积分数1%青霉素和链霉素，pH=7.2）稀释到合适浓度。

1.63种燕窝提取物对H5N1禽流感假病毒的作用将pHA-H5和pNA-N1同时与1个表达荧光素酶且包膜蛋白与Vpr基因缺陷的HIV质粒pNL4-3. Luc.R-E-采用磷酸钙法［4］共转染 293T细胞8～16 h后，换细胞完全培养液，在37℃、含体积分数5%CO2的培养箱中继续培养48 h，收获H5N1假病毒上清，于-80℃保存。将3种燕窝提取物50 μL分别加入到接种293T细胞（1×104/孔）的96孔板内孵育1 h，然后加入50 μL 10×细胞培养液稀释的H5N1假病毒，培养48 h后，加入细胞裂解液裂解细胞30 min，按照荧光素酶检测试剂盒操作方法加样后分别在多功能酶标仪上检测化学发光值（D），吸收波长535 nm。根据D值判断燕窝提取物对H5N1假病毒活性的抑制作用。

1.73种燕窝提取物对H5N1禽流感病毒包膜蛋白的特异性作用为判断燕窝提取物是否特异性地作用于H5N1禽流感病毒的包膜蛋白，本研究采用表达VSV-G的假病毒进行验证。该假病毒与H5N1禽流感病毒比较，仅包膜蛋白不一样。将VSV病毒的包膜蛋白质粒pVSV-G与pNL4-3.Luc.R-E-质粒采用磷酸钙法［4］共转染293T细胞8～16 h后，换细胞完全培养液，在37℃、含体积分数5%CO2的培养箱中继续培养48 h，收获VSV-G假病毒上清，于-80℃保存。将3种不同浓度的燕窝提取物50 μL分别加入接种293T细胞（1×104/孔）的96孔板内孵育1 h，然后加入50 μL 10×细胞培养液稀释的VSV-G假病毒，培养48 h后，加入细胞裂解液裂解细胞30 min，按照荧光素酶检测试剂盒操作方法加样后分别在多功能酶标仪上检测化学发光值（D），判断燕窝提取物对包膜蛋白的抑制作用。

1.8燕窝提取物抑制H5、H7、H9抗原血凝实验①测定血凝价：在96孔微量反应板上，自左至右各孔加25 μL生理盐水；于左侧第1孔分别加50 μL H5、H7、H9型抗原溶液，混合均匀后，吸25 μL至第2孔，依次2倍倍比稀释至第11孔，吸弃25 μL；第12孔以PBS作为对照。自右至左依次向各孔加入体积分数为1%鸡红细胞悬液25 μL（由成年健康公鸡血液，以38 g/L枸椽酸钠溶液1∶4抗凝，加5×生理盐水洗涤，1 500 r/min离心5 min，洗涤3次，取沉淀红细胞用生理盐水稀释而成），在振荡器上振荡，室温下静置，待鸡红细胞沉淀即可观察结果。若红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为1个凝集单位。②测定燕窝提取物对H5、H7、H9抗原引起凝血的抑制作用：将不同浓度的提取物（25 μL）与4个血凝单位的H5、H7、H9型阳性抗原溶液（25 μL）混匀，再加入体积分数为1%鸡红细胞悬液25 μL，在振荡器上振荡，室温下静置，待鸡红细胞沉淀即可评价凝血结果。

1.93种燕窝提取物抗神经氨酸酶活性的作用收集各组燕窝提取物细胞培养液上清，按照神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒操作方法，对空白对照组、NA对照组、燕窝提取物A、B、C组进行酶活力检测。96孔黑色微量板中加入50 μL底物及细胞培养液上清50 μL，混匀后避光置于37℃孵育60 min，每孔加入100 μL终止液终止反应。在多功能酶标仪上测定荧光值（D），荧光激发波长340 nm，吸收波长535 nm，计算燕窝提取物对神经氨酸酶活性的抑制率。计算公式如下：p抑制率（%）=［1-（D药物组-D空白对照组）/（DNA对照组-D空白对照组）］×100%。

2　结果

2.13种燕窝提取物对H5N1禽流感假病毒的作用图1结果显示：3种燕窝提取物对H5N1禽流感假病毒活性均有抑制作用，抑制作用的强度随燕窝提取物浓度增高而增加，3种提取物的作用曲线呈大致平行走向。3种提取物最高抑制率均超过93%。

表1结果显示：3种燕窝提取物中，人工肠液消化物（C）的作用最强，IC50为（2.30±0.62）μg/mL；人工胃液消化物（B）的作用次之，IC50为（4.00± 3.60）μg/mL；水提取物（A）最弱，IC50为（5.29± 1.79）μg/mL。

图1　3种不同浓度的燕窝提取物对H5N1假病毒的抑制作用Figure 1　The inhibitory effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts at different concentrations on H5N1 pseudoviruses

表1　3种燕窝提取物对H5N1假病毒抑制作用的半数有效浓度Table 1　IC50of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts against H5N1 pseudoviruses

2.23种燕窝提取物对禽流感病毒包膜蛋白的作用图2结果显示：3种燕窝提取物对VSV-G假病毒活性均无显著的抑制作用，表明其作用位点可能是包膜蛋白。

2.3燕窝提取物抑制H5、H7、H9亚型抗原血凝实验

2.3.1H5、H7和H9亚型抗原的血凝价表2结果显示：将不同稀释度的H5、H7、H9亚型抗原与鸡红细胞悬液孵育，H5和H7亚型抗原均在稀释度为1∶8 至1∶128时引起血凝反应，而从1∶256开始即不再发生血凝反应，表明其血凝价为1∶128。H9亚型抗原在1∶512不再发生血凝反应，表明其血凝价为1∶256。所以，后续实验均按血凝价为1∶128观察燕窝提取物对H5、H7亚型抗原血凝的影响，按血凝价为1∶256观察燕窝提取物对H9亚型抗原血凝的影响。

图2　3种不同浓度燕窝提取物对VSV-G假病毒包膜蛋白的作用Figure 2　The inhibitory effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts at different concentrations against envelope protein of VSV-G pseudoviruses

表2　H5、H7和H9亚型抗原的血凝实验Table 2　Blood clotting response test for H5，H7 and H9 type antigens

2.3.23种燕窝提取物对H5、H7、H9亚型抗原凝血反应的拮抗作用

2.3.2.13种燕窝提取物对H5亚型抗原发生血凝反应的影响表3结果显示：3种燕窝提取物在一定浓度条件下对H5抗原血凝反应均有抑制作用，样品A、B、C抑制H5抗原发生血凝反应的最低有效浓度分别为 5.21 μg/mL，10.4 μg/mL和10.4 μg/mL。

表3　3种燕窝提取物对H5亚型抗原发生血凝反应的影响Table 3　The effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on blood clotting response to H5 antigen

2.3.2.23种燕窝提取物对H7亚型抗原发生血凝反应的影响表4结果显示：3种燕窝提取物在一定浓度条件下对H7抗原的血凝反应均有抑制作用，样品A、B、C抑制H7抗原发生血凝反应的最低有效浓度分别是5.21 μg/mL，10.4 μg/mL和5.21 μg/mL。

表4　燕窝提取物对H7亚型抗原血凝反应的影响Table 4　The effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on blood clotting response to H7 antigen

2.3.2.33种燕窝提取物对H9亚型抗原发生血凝反应的影响表5结果显示：3种燕窝提取物在一定浓度条件下对H9抗原的血凝反应均有抑制作用，样品A、B、C抑制H9抗原血凝反应的最低有效浓度分别是2.60 μg/ml、5.21 μg/mL和5.21 μg/mL。

表5　3种燕窝提取物对H9亚型抗原发生血凝反应的影响Table 5　The effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on blood clotting response to H9 antigen

2.43种燕窝提取物抗神经氨酸酶活性的作用采用神经氨酸酶（NA）抑制剂筛选试剂盒对3种燕窝提取物（终浓度为1 mg/mL，3个复孔）是否具备抑制神经氨酸酶活性的作用进行了初步研究。图3结果显示：3种提取物对神经氨酸酶均没有抑制作用。

3　讨论

H5N1禽流感假病毒能够感染人胚肾293T靶细胞，并在细胞内复制，通过化学发光法检测在病毒复制过程中共同表达的荧光素酶，即可判断病毒在靶细胞内有无复制以及复制的程度，这已是一个成熟的筛选H5N1禽流感病毒抑制剂的系统，并已成功用于多种抗病毒药物的筛选［5］。因此，本研究选择了此系统研究燕窝提取物的抗病毒作用。

图3　3种燕窝提取物对神经氨酸酶活性的影响Figure 3　The effect of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on neuraminidase activity

血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）这2种糖蛋白对于病毒的传播起着决定的作用。当禽流感病毒进入宿主呼吸道，与上皮细胞接触后，血凝素就会与上皮细胞表面的唾液酸结合，介导细胞将病毒吞入胞内。进入细胞后，病毒就会将其遗传物质释放出来，利用细胞内的核酸复制机制，大量复制病毒自身的遗传物质和蛋白质，并利用细胞膜将其重新包装成新的病毒颗粒，以出胞的形式转移到细胞外，新的病毒颗粒通过血凝素与细胞的唾液酸仍然连接在细胞上［6-9］。另外，血凝素还具有凝集多种红细胞的性质。

本研究结果显示：3种燕窝提取物可抑制H5N1禽流感假病毒对293T细胞的感染活性，但对VSV-G假病毒感染293T细胞的活性均无影响，表明提取物的作用靶点为H5N1禽流感病毒的包膜蛋白，即H5型血凝素或N1型神经氨酸酶。血凝反应实验结果显示：3种燕窝提取物对H5、H7、H9型抗原引起的血凝反应均有抑制作用，但对神经氨酸酶无抑制作用，表明燕窝抗病毒的作用位点在血凝素，而不是神经氨酸酶。

本研究结果还显示：燕窝提取物对H9亚型抗原血凝反应的抑制作用较其对H5和H7亚型的作用略强，抑制H9亚型抗原发生凝血反应的最低有效浓度比对H5和H7亚型的低1个血凝单位，提示燕窝的抗病毒作用可能存在一定的选择性。3种燕窝不同提取物起到抑制H5、H7、H9亚型抗原血凝反应的最低有效浓度均介于2.60～10.4 μg/ mL，但水提取物最低有效浓度低于人工胃液和人工肠液水解产物，表明水提取物的活性较强，而胃液或肠液对水提取物活性有轻度减弱作用，提示胃液和肠液在水解过程中可能破坏了其部分活性成分。

本实验目前仅采用体外试验进行了燕窝抗H5N1病毒的药效评价，虽然取得了令人鼓舞的初步结果，但仍存在一些问题，如未进行体内抗病毒试验、燕窝水解过程的优化、水解产物的分离纯化及其活性评价等，这些都有待下一步研究。

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［3］吕敏.H5N1型高致病性禽流感研究进展及其对人类的威胁［J］.中南大学学报（医学版），2007，32（1）：15.

［4］唐蓓.一种稳定且高效的磷酸钙293T细胞转染法［J］.生物技术，2011，21（1）：49.

［5］YangH.Molecularcharacterizationsofsurfaceproteins hemagglutinin and neuraminidase from recent h5Nx avian influenza viruses［J］.J Virol，2016，90（12）：5770.

［6］Guo C T，Takahashi T，Bukawa W，et al.Edible bird's nest extract inhibits influenza virus infection［J］.Antiviral Res，2006，70（3）：140.

［7］Biddle F，Belyavin G.The haemagglutination inhibitor in edible bird nest：its biological and physical properties［J］.J Gen Microbiol，1963，31（1）：31.

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【责任编辑：侯丽颖】

Effect and Mechanism of Extracts of Nidus Collocaliae on Resisting Avian Influenza A H5N1 Virus

LIN Jieru1，ZHANG Ying1，DAI Weiping1，LIU Shuwen2，LI Geng1，ZHOU Hua3，LAI Xiaoping1
（1.School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.School of Pharmacy，Southern Medical University，Guangzhou 510515 Guangdong，China；3.Macau University of Science and Technology，Macau）

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of the extracts of Nidus Collocaliae on avian influenza A H5N1 virus in vitro.Methods Nidus Collocaliae water extract，artificial gastric juice digestion products of Nidus Collocaliae water extract，and artifitial intestinal juice digestion products of Nidus Collocaliae water extract were prepared for the experimental study.293T cells transfection in vitro was carried out.The effects of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on H5N1 pseudovirus and VSV-G pseudovirus were determined by luciferase detection kit.Blood clotting response to erythrocyte hemagglutinin subtypes H5，H7，H9 antigens and the inhibitory effects of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts were observed.The effects of 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts on neuraminidase activity were determined by neuraminidase inhibitor screen kit.Results The 3 kinds of Nidus Collocaliae extracts had inhibitory effects on H5N1 avian influenza pseudovirus，the effects being enhanced with the increase of the concentrations of Nidus Collocaliae extracts.Of the 3 extracts，artificial intestinal digestion products had the strongest inhibitory effect，while Nidus Collocaliae water extract had the weakest effect. However，Nidus Collocaliae extracts had no obvious effect on VSV-G pseudovirus.The concentration of H5，H7 antigen for positive blood clotting response was 1∶128，and that of H9 antigen was 1∶256.The 3 kinds ofNidus Collocaliae extracts at certain concentrations could inhibit blood clotting response to H5，H7，H9 antigen，but had no obvious effect on neuraminidase.Conclusion The anti-H5N1 virus effect of Nidus Collocaliae extracts has been achieved probably through resisting hemagglutinin.

Nidus Collocaliae/pharmacology；avian influenza A H5N1 virus；cell transfection；blood clotting response

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0710-06

10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．05．021

2015-12-08

林洁茹（1973-），女，副主任中药师；E-mail:linjerry07@qq.com

赖小平，男，教授，博士研究生导师；E-mail:lxp88@gzucm.edu.cn

“十二·五”国际科技合作项目（编号:2014DFH30010）；广东省科技计划项目（编号:2013B090800052、2013B020224005）；广东普通高校国家级重大培育项目（编号:E1-KFD015151K02）