秀丽隐杆线虫在中药研究领域中的应用

冀娇娇，董洁，王贝贝，赵爽，王加利，靳慧慧，袁将，刘永刚

(北京中医药大学 中药学院，北京 100102)

·综述·

秀丽隐杆线虫在中药研究领域中的应用

冀娇娇，董洁，王贝贝，赵爽，王加利，靳慧慧，袁将，刘永刚*

(北京中医药大学 中药学院，北京 100102)

秀丽隐杆线虫具有寿命短、易培养、经济、适于高通量筛选且与活性关联的分子机制清晰等特点，被广泛应用于环境毒性监测、合成化合物活性筛选以及初步毒性评价等领域，是一种新近发展的颇具实用性的整体动物模型。令人惊喜的是，随着其应用范围的扩大，该模式生物已逐渐应用于中药的活性成分研究与毒性评价，并展现出广阔的应用前景；而线虫与中药研究的充分结合，必将成为中药现代化进程的强劲推动力。本研究就秀丽隐杆线虫在中药研究中的应用作一综述。

秀丽隐杆线虫；中药；活性筛选；毒性评价；中药现代化

在医学发展的过程中，中药文化对世界医学发展做出了巨大的贡献，但在中药现代化的问题上，尤其是中药的药效物质基础和作用机制的研究过程中，面临各种挑战[1-2]。因此，在继承中药精髓的同时，寻找新的方法明确中药复方的药效基础与作用机制已经成为当务之急。

1965年起，Sydney Brenner[3]开始用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans，简称线虫)研究器官发育以及细胞凋亡的调控机理。此后，线虫研究中的大量开拓性工作使之成为基础研究的经典模式动物。近年来，线虫还用于环境监测、化学药物毒性初步评价以及基于人类疾病模型的药物筛选。线虫作为整体模式动物，针对中药成分复杂、作用机制不清的特点，在中药活性评价、作用机制阐明和初步毒性评价方面具有独特的优势。本研究将对线虫在生物学研究中的优势、中药毒性评价以及利用多种人类疾病模型进行活性化合物筛选方面进行讨论。

1 秀丽隐杆线虫在生物学研究中的优势

1.1 生理特征

秀丽隐杆线虫是一种在土壤中生存、以微生物和腐烂生物碎片为食、易于繁殖的小型整体模式生物。线虫有五对常染色体与一对性染色体(XX与XO)，分为雌雄同体和雄性个体。在雌雄同体自交的情况下，雄性个体的出生率仅有0.1%[4]。雌雄同体自交使得同一基因型的种群得以稳定维持；而与雄性杂交使得不同基因型得以引入，利于遗传学上下游关系的确定，因而可用于药物作用机制研究。野生型线虫从卵发育到成虫的时间为3 d，包括胚胎期(0～12 h)、幼虫期(L1、L2、L3、L4)、成虫期(3～10 d)[5]。见图1。尽管线虫的解剖学特征很简单，但是却具有大量的行为学特征，例如运动、觅食、喂养、产卵、排便以及灵敏的感觉器官等[6]。正是这些行为学特征，才使得线虫作为整体生物模型被广泛应用。

图1 秀丽隐杆线虫生活周期

1.2 应用优势

近年来，作为生物研究中重要模式动物之一，秀丽隐杆线虫被广泛应用于遗传学、细胞生物学、分子生物学的研究。概况起来有如下优势：1)结构简单，身体透明，易于镜下观察，实验可操作性强；2)生命周期短(2～3周)；3)全基因组序列已知；4)多数以雌雄同体形式存在，易于培养繁殖，3 d可繁殖一代，容易保持基因突变的可遗传性，而且能够冷冻保存；5)大量突变体线虫株可以方便地从秀丽隐杆线虫遗传学中心(CGC)(Caenorhabditis Gentics Center)获得；6)整体动物，与人类基因保守性较高，体内有很多与人类相似的信号通路。有研究[4，7-8]也证实，线虫的基因中有大约42%与人类疾病基因直接同源，可以构建出与人类疾病相似的模型。

2 秀丽隐杆线虫在中药毒性评价方面的应用

近年来，频发的中药不良反应事件使得中药安全性问题逐渐被人们重视起来。传统的中药毒性评价方法是进行一系列的动物实验，大量的动物实验既耗费大量人力、财力和时间，又违背动物保护原则和伦理道德。因此近年来新型的毒性评价技术主要有：P450酶技术、毒理芯片技术、液质联用技术以及应用代谢组学方法等[9-13]。而这些技术都是基于体外系统进行评价，不能模拟体内的复杂环境，得到的结果最终仍需要进行体内验证。线虫作为整体模式动物，由于结构简单、易于培养，对毒性物质的反应敏感性与哺乳动物具有一致性等优点，已经在环境监测领域得到广泛应用[14-15]。同时，在化学药物的毒性评价上，也具有良好效果[16]。李贞景等[17]将线虫引入中药毒性评价体系中，通过监测提取物对线虫致死率和产卵数等的影响，初步评价了4种有毒中药对线虫的影响。随后，Qiao等[18]也应用线虫全面分析芫花的毒性及作用机制。虽然线虫不是哺乳动物，但其对毒性的敏感性，以及毒性刺激时所产生的行为学特征，例如致死率、产卵数、寿命、运动能力、体长变化以及阴户数量变化等，都为毒理学评价初期提供了很好的技术平台。

3 秀丽隐杆线虫在中药活性评价方面的应用

3.1 神经退行性病变

近年来，以阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease，AD)、帕金森综合症(Parkinson’s Disease，PD)、肌肉萎缩性侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)、亨廷顿舞蹈病(Huntington Disease，HD)为主的四大神经退行性疾病对社会的影响越来越大。但是迄今为止，还没有一种针对这类疾病的有效疗法[19]。线虫的神经系统由302个神经元组成，虽然结构简单，但神经元种类完善。同时，多种哺乳动物神经系统中的经典神经递质，如γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸盐、5-羟色胺、乙酰胆碱等在线虫中也是保守的；而且，线虫身体透明，通过体内荧光标记可以对神经元及其亚细胞结构进行活体直接观察，这些优势使其成功应用于治疗神经退行性疾病的药物筛选中。中药具有多组分、多靶点、副作用小等优点，越来越多的研究证实中药复方、单味药、中药提取部位以及中药单体在治疗神经退行性疾病方面有很好的应用前景。

3.1.1 阿尔兹海默病模型 目前公认的阿尔兹海默症的发病机制有两种：淀粉样蛋白Aβ在大脑中的沉积和tau蛋白过度磷酸化积聚[20-21]。线虫常用的AD模型的建立是将人源Aβ1-42肽段在线虫肌肉中异源表达，诱导淀粉样蛋白沉淀形成，引起线虫瘫痪[22]；或者利用aex-3启动子在线虫整个神经系统表达tau蛋白建立模型。研究表明，六味地黄丸的醇提取物(主要为酚醛树脂类化合物)可以通过上调热激蛋白以及减少活性氧(ROS)，明显改善β样淀粉蛋白积聚造成的神经毒性[23]。

3.1.2 帕金森综合症模型 帕金森综合症模型主要有两种：一种是在不同神经元中过表达人α-突触核蛋白(α-synuclein)基因构成的转基因线虫模型；另一种是用神经毒药物如MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)处理的药物诱导模型[24-25]。提取于中药天麻的化合物N6-(4-羟苯基)腺嘌呤核糖苷可以有效激活线虫的A2AR，抑制腺苷转运，从而延缓线虫的帕金森疾病症状[26]。

3.1.3 亨廷顿舞蹈症模型 线虫中的亨廷顿模型是将人源亨廷顿蛋白在线虫神经系统中过表达，造成多聚谷氨酰胺(polyQ)积聚[27]。陈佩雷等[28]以位于头感器中的多类型(polymodal)ASH神经元存活率为指标，研究人参多糖对HA759线虫株中polyQ聚集介导的神经毒性作用。结果发现，人参多糖可以减缓多聚谷氨酰胺的聚集，起到神经保护作用。

3.1.4 肌肉萎缩性侧索硬化模型 线虫的肌肉萎缩性侧索硬化模型主要是引入人源性超氧化物歧化酶(SOD1)、构建人源Tar DNA结合蛋白-43(TDP-43)或者肉瘤融合蛋白-3(FUS)3种方法来形成。Zhang等[29]已对这方面的研究进行总结，认为中草药具有抗氧化应激能力、兴奋性氨基酸神经毒作用、抑制神经炎症反应以及钙离子细胞毒作用，从而有效防治ALS。

3.2 抗衰老

线虫抗衰老研究主要集中在三大信号通路：胰岛素/胰岛素样生长因子-1(insulin/IGF-1)信号通路、Sirtuin家族信号通路以及雷帕霉素靶蛋白(TOR)信号通路。中药在抗氧化、抗衰老方面有着天然优势。目前多种中药提取物，如：白槲寄生提取物、人参多糖、淫羊藿总黄酮、葡萄籽花青素等，都已经被证实可以显著延长线虫寿命[28，30-34]。因此，线虫在中药抗衰老研究中的应用很可能开启人类抗衰老药物开发的新篇章。

3.3 抗肿瘤

秀丽隐杆线虫的发育由高度保守的Wnt、Notch、Ras三大经典信号通路所调控，这三条通路都与人类的肿瘤发生密切相关[5]。这些通路的活性异常调控能够导致线虫的一些特殊表型，如生殖腺顶端细胞(distal ti Pcell，DTC)减少或者过度增殖、生殖细胞或前体细胞过度增殖等，从而造成线虫的不育、生殖腺肿瘤或者多个阴户等表型[35-37]，这些特征使得线虫成为肿瘤药物筛选的理想模型之一。此外，针对中药化合物或者中草药对癌症患者有治疗作用，但是由于其成分复杂，使得作用机制不明确的问题[38]，线虫也提供了可能的解决途径，这一领域尚需要大量的实验数据进行验证和支持。

3.4 抗菌

抗生素滥用导致耐药菌的出现是近年来医学界关注颇多的话题。而中药提取物在抗菌方面却有着副作用小、药效好的优势。Moy等[39]用粪肠球菌感染线虫，并使用该模型筛选出16个化合物、9个提取物，使得线虫成功成为抗菌药物筛选的体内模型。杨再昌等[40]用铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌分别感染线虫，筛选了43种中药，发现水麻叶、黄连、茯苓、知母等药物可以有效抑菌，从而对线虫有较好的保护效果。

3.5 其他

除以上四方面外，线虫也常用作脂质代谢、糖尿病以及慢性疲劳综合症等疾病的药物筛选模型。中草药具有多靶点、多功能等特点，所以将线虫用在与这些疾病相关的中药筛选中也具有良好的应用前景。

4 结语

在中药现代化进程中，首先，中药的安全性问题受到广泛关注，制剂不良反应频频发生：其次，中药有效成分颇多，具有功能多样性，大多是依靠复方来发挥作用，造成物质基础以及作用机制不明确，这些因素使得质疑中药临床应用的声音不断出现，从而阻碍了中药现代化的发展。秀丽隐杆线虫由于其遗传背景清晰、结构简单、生活周期短且有大量的突变体，已成为继果蝇之后的又一分子生物学和发育生物学领域的经典模式动物。在中药研究上，由于线虫是整体动物，复方中药或中药有效部位粗提物可直接进行活性或毒性评价，免于细胞筛选对样品的限制，具有经济、快速的特点；另外，线虫中以突变体或基因过表达建立的疾病模型都有明确的分子基础，一旦活性确定，相关的分子机制即可阐明。因此，这一模式动物在中药药效毒理以及作用机制研究的充分应用很可能成为中药现代化的突破口。

尽管秀丽隐杆线虫在基础生物学研究以及药物毒理研究中有着独特的优势，但是其自身也存在着不可忽视的缺陷，如没有心脏、呼吸系统，不具有获得性免疫，并且与人类种属差异过远，不能完全模拟人类的生理病理状态。然而，线虫在毒性评价以及药物筛选方面的贡献却是不可代替的，应用潜力还有待于进一步挖掘。笔者认为要在谨慎考虑线虫模型缺陷的基础上，充分发挥线虫的多种生物学优势，这样才能将此模型推广应用于中药的新药开发以及作用机制研究，全面提升中药现代化水平。

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ApplicationofCaenorhabditiselegansinFieldofTraditionalChineseMedicine

JIJiaojiao，DONGJie，WANGBeibei，ZHAOShuang，WANGJiali，JINHuihui，YUANJiang，LIUYonggang*

(SchoolofChinesePharmacy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China)

The nematodeCaenorhabditiselegans，a classical model organism with the characteristics of short lifespan，easy to culture，cheap，being suitable for high-throughput screening as well as with abundant mutants for molecular mechanism study，has been broaden its usage widely for environmental pollution monitoring，bioactive compounds screening and preliminary toxicity assessment.Encouragingly，with the extension of its application，C.elegansis making its way into bioactivity and preliminary toxicity assessment of Traditional Chinese Medicine(TCM)，and shows broad developmental prospect.Predictably，application ofC.eleganswill powerfully push the modernization of TCM.In this paper，the current application ofC.elegansin TCM study is reviewed.

Caenorhabditiselegans；Traditional Chinese Medicine；bioactivity screening；toxicity assessment；modernization of Traditional Chinese Medicine

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.030

2015-07-09)

*

刘永刚，副教授，研究方向：新药研发；E-mail：liuyg0228@163.com