紧密连接蛋白1和血管内皮生长因子C蛋白与大肠癌的关系研究*

李　燕，吴密璐，骆玉霜，刘志波，陈　蓉

(青海大学附属医院病理科，西宁 810000)



紧密连接蛋白1和血管内皮生长因子C蛋白与大肠癌的关系研究*

李燕，吴密璐△，骆玉霜，刘志波，陈蓉

(青海大学附属医院病理科，西宁 810000)

目的探讨紧密连接蛋白1(Claudin-1)与血管内皮生长因子C(VEGF-C)在大肠癌组织中的表达情况及二者间的相互关系。方法对该院病理科收集的50例大肠癌组织、癌旁组织及50例正常大肠组织采用免疫组织化学SP法检测，根据患者的年龄、性别、是否发生淋巴结转移、浸润深度、临床分期进行综合比较，分析Claudin-1和VEGF-C蛋白在大肠癌组织中表达的相关性。结果大肠癌组织的Claudin-1、VEGF-C阳性率显著高于癌旁组织和正常大肠组织(χ2=32.270，P=0.000；χ2=41.209，P=0.000)；癌旁组织的Claudin-1、VEGF-C阳性率显著高于正常大肠组织(χ2=7.294，P=0.007；χ2=5.741，P=0.017)。大肠癌组织Claudin-1的表达与分化程度、浸润程度、TNM分期、淋巴结转移具有密切关系(P<0.05)，大肠癌组织VEGF-C的表达与浸润程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤大小具有密切关系(P<0.05)。大肠癌Claudin-1、VEGF-C表达具有显著的正相关关系(χ2=10.953，P=0.001，r=0.468)。结论大肠癌组织的Claudin-1、VEGF-C表达显著高于癌旁组织和正常大肠组织，大肠癌组织的Claudin-1、VEGF-C表达与临床分期等因素具有一定的关系。

血管内皮生长因子；连接蛋白类；肠肿瘤

大肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，每年的发病率和病死率都在持续上升，50%～60% 的患者死于肿瘤复发和转移[1]。肿瘤的发生、发展与转移是一个复杂的、多步骤、多因素相互作用的动态过程，有研究显示紧密连接蛋白1(Claudin-1)和血管内皮生长因子C(VEGF-C)在大肠癌组织中呈现高表达状态，与肿瘤的发生、浸润、淋巴转移有关。Claudin-1对于维持上皮屏障结构的稳定性及细胞间物质交流具有重要作用；VEGF-C能诱导肿瘤外周形成新的淋巴管，使肿瘤细胞从新生淋巴管转移[2]。本研究通过免疫组织化学方法检测Claudin-1和VEGF-C在大肠癌组织、癌旁组织及正常大肠组织的表达情况，分析两种蛋白与大肠癌的相关性，为大肠癌的诊断及预后评价提供参考，现将结果报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料本研究选取本院病理科2013年3月至2014年12月收集的50例大肠癌组织、癌旁组织及50例正常大肠组织标本。纳入标准：经病理确诊并接受过放射、化学药物治疗的大肠癌组织；正常大肠组织经过病理组织学检查排除癌变及其他相关病变，来源于肠镜检查排除肿瘤病变的患者。本次研究共纳入150例标本，大肠癌组织组50例，男28例，女22例；年龄48～74岁，平均(58.4±7.2)岁；50例均为腺癌，其中结肠癌23例，直肠癌27例；分化程度：高分化18例，中分化21例，低分化11例；浸润深度：浆膜层以内21例，浆膜层以下29例；淋巴结转移22例，未转移28例；TNM分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期16例，Ⅲ期15例，Ⅳ期6例。癌旁组织50例标本取自上述50例确诊的大肠癌患者的癌旁组织。正常大肠组织50例，男32例，女18例；年龄44～76岁，平均(60.4±8.1)岁。3组标本上述一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2仪器与试剂石蜡切片机 RM2235(德国 LEICA 公司)，OlympusBX51型电子显微镜(日本Olympus公司)，脱水机 ASP300S(德国 LEICA 公司)，包埋机 EG1150H(德国 LEICA 公司),Claudin-1 兔抗人多克隆抗体(博奥森 bs-1428R Rba),VEGF-C多克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司),免疫组织化学SP试剂盒(福州迈新生物有限公司)。

1.3检测方法取患者的大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织浸泡于10%福尔马林溶液固定24 h，对组织进行修块，分别浸泡于70%乙醇3 h、80%乙醇3 h、90%乙醇3 h、100%乙醇Ⅰ3 h、100%乙醇Ⅱ3 h、二甲苯Ⅰ30 min、二甲苯Ⅱ30 min，在67 ℃恒温中浸蜡30 min，包埋，修蜡块。使用切片机进行连续4 μm切片，42 ℃展片，67 ℃烤片2 h，然后经过二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、100%乙醇Ⅰ 5 min、100%乙醇Ⅱ 5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min，枸橼酸盐缓冲液92～98 ℃ 30 min进行抗原修复，然后根据免疫组织化学试剂盒说明书进行染色，显微镜下观察并摄片，每张切片在400倍显微镜下选定10个视野计算阳性细胞的百分数，VEGF-C阳性物质呈棕黄色细颗粒状，定位于胞质，Claudin-1阳性物质呈棕黄色细颗粒状定位于胞质和包膜，阴性细胞数小于10%(-)，阳性细胞数大于或等于10%(+)。

2　结　　果

2.13种不同大肠组织中Claudin-1、VEGF-C表达情况大肠癌组织的Claudin-1、VEGF-C阳性率显著高于癌旁组织和正常大肠组织(χ2=32.270，P=0.000；χ2=41.209，P=0.000)；癌旁组织的Claudin-1、VEGF-C阳性率显著高于正常大肠组织(χ2=7.294，P=0.007；χ2=5.741，P=0.017)。见表1。

表1　　3种大肠组织中的Claudin-1、VEGF-C阳性率

2.2不同大肠癌临床特征与Claudin-1、VEGF-C表达的关系大肠癌组织Claudin-1的表达与分化程度、浸润程度、TNM分期、淋巴结转移具有密切关系(P<0.05)，大肠癌组织VEGF-C的表达与浸润程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤最大径具有密切关系(P<0.05)。见表2。

表2　　大肠癌不同临床特征与Claudin-1、VEGF-C表达的关系

2.3大肠癌患者的Claudin-1、VEGF-C表达的相关关系大肠癌Claudin-1、VEGF-C表达具有显著的正相关关系(χ2=10.953，P=0.001，r=0.468)，见表3。

表3　　大肠癌患者的Claudin-1、VEGF-C表达的相关性

χ2=10.953，P=0.001，r=0.468。

3　讨　　论

肿瘤的发生是多因素、多基因参与的复杂过程，从基因水平探讨大肠癌的发生发展规律、发病基础，以及发病机制，将对大肠癌的诊断及治疗提供重要依据。本研究通过对大肠癌组织中Claudin-1和VEGF-C的表达进行分析，初步阐明了二者在大肠癌发生发展中的作用。

Claudin-l属于紧密连接蛋白家族，是Furuse于1998年发现的位于人染色体3q28-q29编码21个氨基酸的基因[3]，其主要作用是参与细胞与细胞间的紧密连接，调控细胞间的物质交换[4]。有研究显示，很多肿瘤的发生发展过程中Claudin-l表达异常，如大肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、胃腺癌等[5]。很多研究显示，结肠癌组织中Claudin-1呈现过表达状态，但是Claudin-1表达上调的意义尚不明确。Wnt 和Notch信号通路在正常结肠的发育过程中具有重要作用，Claudin-1是Tcf/Lef信号的靶分子，也是Wnt 和Notch信号通路的启动环节，结肠癌组织中Claudin-1的高表达导致Wnt 目标基因上调，如原癌基因、cyclin D1和c-myc等，对于肿瘤的发生具有重要作用。本研究结果显示，大肠癌组织中Claudin-l的表达水平高于癌旁组织和正常大肠组织，提示Claudin-1表达的位置与量的异常促成了肿瘤的发生。随着大肠癌的发展，膜蛋白Claudin-1表现出自细胞膜向细胞质转移的趋势，作为细胞与外界沟通桥梁的细胞膜发生改变，导致细胞内外信息传递异常，从而引起肿瘤发生转移。同时本研究结果显示Claudin-1表达与大肠癌的分化程度、浸润程度、TNM分期、淋巴结转移具有密切关系，可能的机制为Claudin-1过表达可能抑制E-Cadherin的表达，上调β-Cadherin/Tcf信号通路，最终导致肿瘤发生发展，或者Claudin-1过表达诱导金属基质蛋白酶2(MMP2)表达，使正常细胞具有侵袭能力，从而促进肿瘤转移。有研究显示APC Min 结肠癌模型小鼠的生存期限较健康鼠明显降低，可能与Claudin-1过表达有关，与本研究结果有相似性[6]。

VEGF-C属血管内皮生长因子和血小板生长因子家族，是Jeltsch等1997年发现的位于人类染色体的4q34编码119个氨基酸的基因[7]，是第一个报道的淋巴增长刺激因子，可以调节淋巴内皮细胞的增殖和分化，促进肿瘤淋巴结转移，VEGF-C的异常表达与食管癌的不良预后有关，被认为是预测淋巴结转移的有效指标[8]。很多研究中显示VEGF-C的表达是淋巴结转移、远处转移和预后不良的象征[9]。本研究显示VEGF-C在大肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织和正常大肠组织，提示VEGF-C在大肠癌的发生过程中具有重要作用，与大肠癌的浸润、分期、淋巴转移有关；可能原因是VEGF-C由癌组织产生后，通过自分泌和旁分泌的形式与VEGFR-3结合，通过MEK/ERK及PI3K激酶/AKT途径诱导内皮细胞增殖和迁移从而导致肿瘤淋巴管和血管的新生，改变肿瘤胞外基质的黏附性，促进肿瘤的转移浸润[10]。

本研究对Claudin-1和VEGF-C的表达进行了相关性分析，结果显示二者表达具有明显的正相关关系，即随着大肠癌分化程度的升高，Claudin-1和VEGF-C的表达逐渐降低，Ⅲ+Ⅳ期患者的阳性率明显高于Ⅰ+Ⅱ期，有淋巴结转移的患者二者的表达高于未出现淋巴结转移的患者，提示Claudin-1和VEGF-C的表达均与大肠癌的分化、转移、分期等有关，因此对Claudin-1和VEGF-C的表达进行分析可以为大肠癌患者预后和生存判断提供重要依据。

综上所述，大肠癌组织中Claudin-1和VEGF-C呈现高表达状态，与肿瘤的分化、转移、分期具有密切联系，而且Claudin-1和VEGF-C的表达水平呈正相关，Claudin-1和VEGF-C两基因参与了大肠癌的发生发展过程，是肿瘤转移基因，促进肿瘤的发生和转移。对大肠癌患者的Claudin-1和VEGF-C表达水平进行检测，可以作为大肠癌患者诊断、生存及预后评价的参考指标。

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Relationship of Claudin-1 and VEGF-C protein with colorectal cancer

LiYan,WuMilu△,LuoYushuang,LiuZhibo,ChenRong

(DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining,Qinghai810000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of tight junction protein 1(Claudin-1) and vascular endothelial growth factor C(VEGF-C) in colorectal carcinoma tissues and the relationship between them.MethodsTotally 50 cases of colorectal carcinoma,paracancerous tissues and 50 cases of normal colorectal tissues from Department of Pathology were detected by immunohistochemistry SP method,according to the patient′s age,gender,lymph node metastasis,depth of invasion,clinical stage for comprehensive comparison,and analyze the Claudin 1 and VEGF-C protein expression in colorectal cancer tissues.ResultsThe positive rates of Claudin-1,VEGF-C in colorectal cancer tissues was significantly higher than that in paracancerous tissue and normal colorectal tissues (χ2=32.270,P=0.000;χ2=41.209,P=0.000),the positive rate of Claudin-1,VEGF-C in paracancerous cancer tissues was significantly higher than that in normal colorectal tissues (χ2=7.294,P=0.007;χ2= 5.741,P=0.017).The expression of colorectal carcinoma Claudin-1 had close relationship with differentiation,invasion degree,TNM stage,lymph node metastasis(P<0.05),the expression of VEGF-C had colse relatons with infiltration degress,TNM stage,lymph node metastasis,tumor size(P<0.05).The expression of colorectal cancer Claudin-1,VEGF-C had significantly positive correlation (χ2=10.953,P= 0.001,r=0.468).ConclusionThe expression of colorectal cancer Claudin-1,VEGF-C was significantly higher than that in paracancerous tissue and normal colorectal tissue,the expression of Claudin-1,VEGF-C had a certain relationship with clinical staging.

vascular endothelial growth factor;connexins;intestinal neoplasms

李燕(1980-)，主治医师，本科，主要从事肿瘤内科相关专科如肺癌或消化道肿瘤等研究。△

， E-mail:bgthsr@163.com。

论著·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.014

R735.3

A

1671-8348(2016)07-0909-03

2015-09-10

2015-11-20)