生物降解对疯草营养成分与苦马豆素含量影响的研究

2016-09-21刘忠艳郭亚洲薛瑞旭赵宝玉马青成王德军达能太

动物医学进展 2016年8期

刘忠艳，郭亚洲，薛瑞旭，赵宝玉*，马青成，王德军，达能太

(1.西藏大学农牧学院动物科学学院，西藏林芝 860000；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；3.内蒙古阿拉善左旗动物卫生监督所，内蒙古阿拉善 750300)

刘忠艳1，郭亚洲2，薛瑞旭2，赵宝玉2*，马青成3，王德军3，达能太3

为研究生物发酵降解对疯草营养成分与苦马豆素含量的影响，采用混合青贮技术对疯草类有毒植物变异黄芪有毒成分苦马豆素进行生物降解处理，测定降解处理前后变异黄芪营养成分及苦马豆素含量变化情况。结果表明,变异黄芪经生物降解处理后其营养成分变化较小，而苦马豆素含量平均下降了78.09%。该处理方法简单经济、毒素降解高效，适宜在我国疯草威胁区域推广。

疯草；变异黄芪；苦马豆素；生物降解；营养成分

中国有天然草地3.93亿hm2，占全国国土面积的41.7%，可利用天然草地面积3.31亿hm2，居世界第2位，但由于草地荒漠化严重，中国单位面积草地的畜产品生产水平只有新西兰的1/80，美国的1/20，澳大利亚的1/10[1-2]。草地荒漠化主要表现在草地沙化和退化，可食牧草生产量降低，而适应性更强的毒草大量滋生，草地毒草成为威胁草地生态平衡发展的因素之一。疯草是世界范围内影响草地畜牧业发展最为严重的毒草，其蔓延直接破坏草地生态平衡。在中国，疯草已成为西部天然草地主要毒害草之首，每年造成的直接经济损失高达数10亿元，并有进一步扩大的趋势[3-5]。本地家畜一般不主动采食疯草，但因其返青较早，在可食性牧草匮乏的季节，家畜多因被迫采食而导致慢性中毒，引起神经症状和繁殖障碍，严重者甚至导致死亡。疯草有毒成分是吲哚里西啶生物碱——苦马豆素(swainsonine，SW)，因其竞争性抑制α甘露糖苷酶的活性，致使动物机体甘露糖贮积而出现广泛性空泡变性，苦马豆素含量高低也直接影响着疯草毒性的大小[6-7]。疯草虽然有毒，但属豆科植物，营养成分丰富，甚至能与同科的苜蓿媲美，是一种潜在的牧草资源[8-9]。

疯草的传统防控措施包括人工防除和化学防除，前者费时费力，防除效果较差，而后者对草原生态环境造成破坏严重，且防除难于彻底。现代采用的防控方法主要有合理轮牧、药物防控、免疫防控和搭配饲喂等。轮牧对于疯草分布较广及灾害较严重的区域无法使用，药物防控主要利用解毒剂和解毒丸等，有较好的防控效果，但仍需每年投药。疯草毒素疫苗注射是预防动物疯草中毒的理想方法，但还存在疯草毒素疫苗抗原性低、免疫机制不清楚和疫苗成本高等不足，在生产实际很难推广[10-12]。脱毒利用能很好的规避上述缺点，也是近年疯草研究的热点，传统的脱毒方法是利用苦马豆素水溶性及碱性，应用清水或酸水浸泡脱毒，但因脱毒效率较低，对疯草营养成分有所破坏，效果不理想而未得到推广，于是国内学者开始寻求其他脱毒方法，生物降解便是近年兴起的脱毒新思路。为研究生物降解对疯草毒性成分降解效果及营养成分是否产生破坏，本试验以疯草类有毒植物变异黄芪为材料，在进行生物降解脱毒的基础上，测定其营养成分和苦马豆素含量的变化，评价生物降解对疯草营养价值和毒素含量的影响，为疯草的脱毒利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料变异黄芪地上部分，2014年7月采自内蒙古阿拉善左旗巴音洪格日。

1.1.2主要试剂双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)∶三甲基氯硅烷(TMCS)=99∶1(硅烷化试剂)，美国SUPELCO公司产品；苦马豆素标准品，由西北农林科技大学动物医学院生物毒素与分子毒理试验室提供;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3主要仪器4530原子吸收分光光度计，上海精科天美科学仪器有限公司产品；GC-14C气相色谱仪，日本岛津公司产品；AT. SE-54型毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm)，中国科学院兰州化学物理研究所色谱技术研究开发中心产品；BP211D型电子天平，德国Sartorius公司产品；Anke TGL-16G高速离心机，深圳安科高技术股份有限公司产品。

1.2方法

1.2.1变异黄芪生物降解处理采用混合青贮法，采集的变异黄芪切成4 cm～6 cm，每50 kg样品中加2 kg玉米粉，装入青贮塑料袋分层压实，排净空气，封好袋口，保证青贮期间青贮塑料袋不留缝隙，并控制青贮料的pH 4～4.2。经处理后30 d取样待检。

1.2.2处理前后营养成分含量检测测定变异黄芪生物降解处理前、后的营养成分，包括干物质、粗灰分、粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、无氮浸出液、钙、磷及微量元素硒、铁、锌、铜、锰等。其中粗蛋白采用凯氏定氮法测定，粗脂肪采用索氏浸提法测定，粗纤维采用酸碱分次水解法测定，粗灰分采用干灰化法测定，无氮浸出液(%)=(1-粗蛋白-粗脂肪-粗纤维-粗灰分)×100%，干物质通过烘干法测定，EDTA直接容量法测定钙含量，磷钼钒酸比色法(钼黄法)测定磷含量，比色法测定硒含量，其余微量元素通过原子吸收光谱测定。

1.2.3绘制标准曲线取220 μg苦马豆素标准品，100 μL吡啶溶解，等浓度梯度稀释为8组，按体积比5∶2加入BSTFA+TMCS试剂混匀，60℃静置30 min后，分别取2 μL上样，气相色谱检测3次，取平均峰面积。气相色谱条件：柱温210℃，进样口温度300℃，氢火焰离子化检测器(FID)温度280℃，分流比为60∶1，载气为高纯氮气，载气压力200 kPa。以苦马豆素标准品浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并计算线性回归方程。

1.2.4苦马豆素含量测定变异黄芪生物降解处理前40 g、处理后40 g和120 g的植物样品经750 mL/L乙醇加热回流，回收制得总浸膏。总浸膏经1 mol/L HCl酸化，氯仿萃取除杂，用NaOH调节pH至9～10，正丁醇充分萃取分别得到待检浸膏0.76、0.35、1.73 g。

采用气相色谱法测定变异黄芪生物降解处理前、后的苦马豆素含量。称取少量待检浸膏(分别为50.667、50、86.5 mg)经60 μL吡啶分3次充分溶解，按体积比5∶2加入BSTFA+TMCS试剂混匀，60℃静置30 min后按上述方法上样检测。根据回归方程计算吡啶溶液中苦马豆素浓度c(μg/μL)，按以下公式计算样品中苦马豆素含量x。

其中m1为待检浸膏总质量，m2为称取浸膏质量，m3为植物质量。

2　结果

2.1生物降解前后营养成分检测结果

疯草生物降解处理前后营养元素比较结果见表1和表2。结果表明，疯草经生物降解处理后其主要营养成分改变较小，其中粗灰分有所下降，而粗蛋白增加，有推广应用价值。微量元素含量除硒元素以外，其他均有所增加。

表1　生物降解前后变异黄芪主要营养成分含量

表2　生物降解前后变异黄芪异黄芪微量元素含量

2.2生物降解前后苦马豆素含量测定

通过对一系列浓度梯度的苦马豆素标准品进行气相测定,结果见表3。对苦马豆素标准品浓度x对进样峰面积y进行线性回归分析，其线性关系为：y=7 118x+143.3，R2=0.988 93，线性关系良好，标准曲线见图1。

经计算，生物降解前后，变异黄芪中苦马豆素含量分别为0.023 73‰、0.005 54‰、0.004 86‰(表4)，经生物降解，苦马豆素含量平均下降了78.09%，下降效果明显。

表3　苦马豆素标准品梯度浓度平均峰面积

图1　苦马豆素含量标准曲线

样品Samples平均峰面积Averagepeakarea含量/‰Content降解处理前Pre-processing55040.02373降解处理后1Post-processing128230.00554降解处理后2Post-processing226140.00486

3　讨论

中国天然草地毒草危害面积约3 330万hm2，其中疯草分布面积不低于1 100万hm2，占全国可利用天然草地3.3%，且主要分布于内蒙、青海、西藏等西部牧区[13]。毒草孳生另一方面也使可食牧草资源减少，不但破坏植物生态平衡，也直接影响畜牧业发展。而疯草中粗蛋白和粗脂肪含量较高，富含动物发育所需的各种矿物元素和多种氨基酸，各种营养成分近似于苜蓿，是一种潜在的牧草资源[8-9]。疯草对家畜主要造成慢性神经毒性，传统利用方法包括搭配使用、轮牧和间歇饲喂，但因综合利用效率低下，不能从根本上解决疯草的危害问题。苦马豆素属生物碱，且具有较强的水溶性，有人提出利用酸水浸泡脱毒，但对疯草营养成分有所破坏[3]。生物降解是疯草类植物脱毒利用的一种较为理想的脱毒方法，有学者从埋疯草土壤中分离出苦马豆素降解菌，但还未见用于临床研究[14]。

本试验表明，疯草经生物降解处理后，其毒性成分苦马豆素含量综合下降78.09%，下降幅度明显，这也使疯草毒素降解后的利用成为了可能。莫重辉等[15]通过同样方法对黄花棘豆进行毒素降解处理，试验羊在连续投服添处理后的黄花棘豆60 d没有出现典型中毒症状，进一步表明该法去毒效果良好。同时变异黄芪经过毒素生物降解后其营养成分中粗灰分下降较多，其余营养成分变化不大，粗脂肪和粗蛋白还有所增加，微量元素除硒元素以外，其他微量元素全部增加，表明按本文方法进行生物降解处理不会对疯草营养成分造成破坏。这对于我国干旱缺草和多种微量元素长期缺乏，造成骆驼和羊摇摆病及羊食毛症等多种微量元素缺乏症，通过饲喂青贮疯草可有效地预防以上疾病。同时，此处理方法简单，农牧民易掌握，不仅可将采挖的疯草利用，而且经过毒素降解后饲喂，能改善疯草的适口性，在牧草资源匮乏的地区，可用于春季和冬季补充营养成分。因此，该法适宜在牧区广泛推广。

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Study on Contents Change of Nutrients and Swainsonine in Locoweed by Biodegradation

LIU Zhong-yan1, GUO Ya-zhou2, XUE Rui-xu2,ZHAO Bao-yu2,MA Qing-cheng3,WANG De-jun3, DA Neng-tai3

(1.Animal Science College, Tibet Agriculture and Animal Husbandry College，Tibet University，Linzhi,Tibet,860000,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China；3.AlashanZuoqiVeterinaryStation,Alashan,InnerMongolia,750300,China)

To study on contents change of nutrients and swainsonine in locoweed by biodegradation,Biodegradation of swainsonine inAstragalusvariabiliswas carried out by fermentation.The contents of nutrients and swainsonine were determinate before and after biodegradation. Its showed that the content change of nutrients was small, and the content of swainsonine fell by 78.09%.The method is simple and economic,and the degradation of toxin is highly efficient.Its suitable for the promotion of threat regional of locoweed.

locoweed;Astragalusvariabilis;swainsonine;biodegradation; nutrients

2016-03-07

农业部“十二五”公益性行业(农业)科研专项(201203062)；西藏自治区科技厅自然基金项目(2015ZR-13-31)

刘忠艳(1982-)，男，四川邻水人，硕士研究生，主要从事动物中毒病与营养代谢性疾病研究。*通讯作者

S859.87

1007-5038(2016)08-0056-04