改良三联抗生素糊剂在犬牙髓血管再生术中的应用

周荣汇， 陈跃敏， 汪育敏， 涂玉旺， 黄晓晶



改良三联抗生素糊剂在犬牙髓血管再生术中的应用

周荣汇1， 陈跃敏1， 汪育敏2， 涂玉旺2， 黄晓晶1

目的研究改良三联抗生素糊剂在犬牙髓血管再生术中对牙齿变色、根管消毒和牙根继续发育的作用。方法取4只6月龄Beagle犬，随机抽取20颗牙作为实验牙建立慢性根尖周炎模型。采用改良的三联抗生素糊剂(将其中的米诺环素替换为头孢克洛)行根管消毒后刺激根尖形成血凝块并严密封闭冠部。3月后观察牙体变色情况，对实验牙拍摄根尖X线片并行苏木素-伊红染色。结果3月后有4颗出现不同程度变色；90%实验牙炎症得到控制；实验牙均有不同程度的根尖暗影缩小、根尖孔缩小、牙根长度增长、管壁增厚。结论采用改良的三联抗生素糊剂中的进行根管消毒，不仅发生牙体变色的风险低，且获得了良好的根管消毒效果，牙根继续发育。

血管/生理学； 牙； 牙髓； 牙根； 根尖周炎； 慢性病； 根管冲洗剂； 根管疗法； 消毒

2001年，牙髓血管再生术首先在人年轻恒牙根尖周炎的治疗中取得成功[1]，随后有学者在临床和动物模型上对该方法的疗效及机理进行验证和深入研究[2-4]。但是人们发现采用牙髓血管再生术后常常出现牙齿变色[5-7]。已有研究证实，根管消毒使用的三联抗生素糊剂(triple antibiotic paste，TAP)中的米诺环素可增加牙齿变色的风险[6-7]。本研究通过将传统TAP中的米诺环素替换为头孢克洛，评估改良后的TAP对感染根管的牙体变色、消毒效果和根尖区新生组织构成的影响。同时，通过动物实验评估牙髓血管再生术对牙根继续发育的影响，为该方法进一步运用于临床提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物雄性健康6月龄Beagle犬4只，8～9 kg[成都达硕生物科技有限公司，许可证号：SCXK(川)2013-24]。

1.1.2药物甲硝唑(批号：H4402412，广东康美药业有限公司)；环丙沙星(批号：H33020388,浙江京新药业)；头孢克洛(批号：H10960083,广州白云山制药股份有限公司)；胶原纤维栓(美国Zimmer公司)；矿化三氧化物聚合体(mineral trioxide aggregate，MTA，美国Densply公司)；流体树脂(日本Kuraray公司)；布洛芬(批号：H20013193，西南药业股份有限公司)。

1.1.3仪器便携式拍片机(BL-X5，华润口腔材料有限公司)；荧光倒置相差显微镜及照相系统(CKX41，日本Olympus公司)；组织摊烤烘片机(KD-PⅢ，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；组织包埋机(KD-BMIII，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)。

1.2方法

1.2.1慢性根尖周炎(chronic apical periodontitis，CAP)模型的建立选取4只Beagle犬，在每只犬上颌双侧第2，3前磨牙及下颌双侧第2，3，4前磨牙中随机抽取30颗牙作为实验用牙，其中10颗牙作为健康对照组，余20颗实验牙均建立CAP模型。术前拍X线片。在无菌条件下，先用桃形金刚砂车针磨除牙尖，2#快机球钻开髓，拔髓针拔出牙髓组织。从犬牙刮取的龈上菌斑与生理盐水混合，用小棉球蘸取后置于髓腔，Cavit暂封[2]。术后X线片监视根尖情况，每周1次，根据根尖周指数(periapical index，PAI)标准进行评价[8]：当根尖X线影像分级≥2级(根尖孔以外的根周膜不规则增宽，其上方骨质结构轻度紊乱，部分骨小梁粗细不均，根面可有吸收)时即可诊断为根尖周炎(图1)。

1.2.2根管消毒改良抗生素糊剂的制备：甲硝唑、环丙沙星、头孢克洛去除糖衣，研磨成粉末，按重量比1∶1∶1混合均匀，加生理盐水调拌至稀糊状备用，终浓度为0.1 g/mL。犬术前禁食，全身麻醉后拍摄术前根尖X线片，成功建立CAP模型后，去除实验牙冠方暂封物和棉球，0.5%次氯酸钠(sodium hypochlorite，NaClO)使用侧方开口冲洗针缓慢冲洗(10 mL/根管)，待冲洗液清亮无杂质后，无菌纸尖拭干根管。将改良TAP放入注射器后注射于根管中，根据术前根尖X线片确定牙根长度，注射针头进入的深度为牙根长度约2/3，以减少对根尖周围组织的损伤。注射的糊剂止于根管口，湿棉球拭净髓腔，去除多余糊剂，Cavit暂封。术后随访观察实验牙的牙体变色情况、暂封物和牙龈情况。若牙龈出现脓肿或瘘管，或根尖暗影继续扩大，或3周后去除冠方暂封物后仍有脓血，则提示根管内炎症未控制，需更换TAP至炎症消除。

1.2.3刺激形成血凝块取无菌25# K锉刺激根尖出血，液平面位于根管口下方约2～4 mm，用无菌小棉球蘸生理盐水挤干后置于髓腔中，静置约15 min。形成血凝块后去除髓腔中的小棉球，胶原纤维栓覆盖于血凝块表面，便于后续MTA的充填。湿棉球拭净髓腔。在胶原纤维栓和根管口之间放置MTA，用湿棉球拭净髓腔中多余的MTA，并在髓腔内放置湿棉球，30 min后去除湿棉球，轻吹干，自酸蚀后流体树脂分层光照固化，严密封闭。

术后实验牙采用平行投照的方法拍摄根尖X线片，动物完全苏醒后喂服布洛芬，每只0.1 g，进软食。观察3月。观察期间严密关注实验牙是否出现牙体变色、瘘管，牙齿及充填物是否折裂、脱落等。

1.2.4X线片观察X线片观察指标：(1)根尖暗影是否有缩小趋势；(2)根尖孔是否有缩小的趋势；(3)牙根长度是否增长；(4)根管壁是否增厚。由同一位实验员作为X线片观察者。

1.2.5组织病理学检测经上述拍摄完根尖X线片后，犬在仍处于全身麻醉状态下正中切开颈部皮肤，分离肌肉和筋膜，在颈动脉鞘内小心分离并暴露颈总动脉、颈内静脉和迷走神经。结扎双侧颈总动脉近心端，迅速于远心端插管并固定后剪断双侧颈内静脉。双侧同时用1 500 mL PBS液灌注置换至冲洗液清亮，后改用4%中性多聚甲醛约1 500 mL重复上述操作，待犬口腔粘膜颜色发白、质地变硬即完成多聚甲醛的灌注内固定。拔出健康对照牙和实验牙，置于4%中性多聚甲醛中，室温下固定48 h。流水冲洗30 min，10%中性EDTA溶液浸泡脱钙6月，每3～4天更换1次，至细针可轻松刺入骨和牙体组织即可完成脱钙。流水冲洗1 h并去除牙冠，后按照以下步骤进行操作：(1)脱水：70%酒精3 h，80%酒精3 h，90%酒精3 h，95%酒精1.5 h，无水乙醇+正丁醇(1∶1)1.5 h，正丁醇5 h。(2)浸蜡：正丁醇+石蜡(1∶1)1 h，石蜡I(56～58 ℃)1 h，石蜡Ⅱ(60～62 ℃)1 h。(3)石蜡包埋与切片：样本使用自动石蜡包埋机进行包埋，待冷却后用半自动石蜡切片机切片，沿通过根尖孔的牙体长轴切4 μm的石蜡切片，60～62 ℃烤片2 h，脱蜡入水，苏木素-伊红(H-E)染色，中性树胶封片，镜下观察结果。

2　结　果

2.1改良TAP根管消毒效果及牙体变色情况改良TAP消毒3周后，2组牙的牙冠均未发生变色。但其中有2颗实验牙牙龈出现瘘管，X线片示根尖暗影较术前扩大。上述2颗实验牙去除暂封物后根管内仍有脓血，其余实验牙未出现上述症状，即有90%的实验牙控制了炎症。对于TAP消毒3周后炎症仍未控制的，则更换TAP糊剂；至第4周时均未再出现瘘管，去除暂封物后根管内无脓血。

进行牙髓血管再生术后3月，实验牙均未再发现瘘管，充填物均未脱落。与健康对照牙比较，20颗实验牙中4颗出现不同程度变色，透过表层的釉质和牙本质可见髓腔呈暗灰色(图2)。

2.2X线片术后3月实验组18颗根尖暗影有缩小趋势，10颗根尖孔有缩小趋势，12颗牙根长度增长，11颗管壁增厚。健康对照组中10颗牙根尖无暗影，牙根长度增长，管壁增厚，根尖孔缩小。

2.3H-E染色20颗实验牙共40个根管内均有血管、类牙骨质、类骨以及类牙周膜等组织生成。新生组织由根管外侧壁向根管内侧长入。实验牙根管内均未发现新生牙本质的形成。实验牙根管壁增厚主要来源于类牙骨质贴着牙本质内壁由下向上生长，其内部无牙本质小管，但含牙骨质样细胞(图3)。新生的类骨样组织不直接贴附在牙本质壁上，而是以钙化小岛或骨样小梁形成于根管中(图4)。健康对照组中根管腔内见牙髓组织，内含大量成纤维细胞、血管内皮细胞等，根管内侧壁可见成牙本质细胞呈栅栏状附于牙本质层上。

3　讨　论

既往研究报道中较常使用杂种犬作为实验动物[4,9-10]，但由于该种犬攻击性强、个体差异大等因素，本研究中选用Beagle犬。与杂种犬比较，该犬性格温和，遗传性疾病少，实验重复性好，尤其适合药理、循环生理、毒理、外科学等研究，是国际医学、生物学界公认的较理想的实验用犬。钟小奕的研究采用1只犬进行实验[4]，而本研究选用4只犬，降低了因个体差异对实验造成的影响。

传统的TAP除了因含抗生素导致部分患者可能出现过敏症状外，还存在使牙齿变色的风险。已证实牙齿变色来源于TAP中的米诺环素[6-7]。Thibodeau和Trope在临床上用头孢克洛代替米诺环素，不仅取得良好的消毒效果，而且牙齿未出现变色[7]。本研究将传统TAP中的米诺环素更改为头孢克洛，经改良TAP消毒3周后，20颗实验牙牙冠均未发生变色。但观察3月后，20颗实验牙中4颗出现不同程度变色，透过表层的釉质和牙本质可见髓腔呈暗灰色。文献证实，在临床上使用甲硝唑、环丙沙星、头孢克洛的TAP进行根管消毒后并不会引起牙齿变色[7]，故本研究出现牙冠变色更可能是由于以下因素引起：(1)根管内残留的血液。年轻恒牙根尖区血运功能旺盛，刺激出血液后溢至髓腔中而未拭净，或是MTA充填完成后仍有血液渗出，这些红细胞残留于髓腔中，其分解产生的色素渗入牙本质小管中使牙本质变色，透过釉质而使牙齿呈现暗灰色。(2)MTA。MTA有良好的生物学活性，可刺激根尖区组织再生[11-12]。MTA还是优良的封闭剂，在根管口起到严格封闭冠方的作用。但MTA有造成牙齿变色的风险[5,13-14]，且变色的部位主要是MTA本身，因此建议将TAP置于釉牙骨质界以下[15]。

传统的TAP(甲硝唑、环丙沙星、米诺环素)对于坏死感染根管内常见的细菌有很好的效果[16]。Windley等在患有慢性根尖周炎犬牙根管内使用浓度为20 mg/ mL的TAP消毒，具有很好的根管消毒效果[17]。本研究将传统三联抗生素中的米诺环素更改为头孢克洛。头孢克洛是广谱半合成头孢菌素类抗生素，对多种革兰氏阳性和阴性菌均具有较强的杀灭作用。本研究中经改良TAP消毒3周后，90%的实验牙控制了炎症，说明本研究虽改变了TAP的组成，将米诺环素更改为头孢克洛，但仍取得了良好的根管消毒效果。同时影像学观察显示，共有10颗牙根尖孔有缩小趋势，12颗牙根长度增长，11颗管壁增厚，因此改良的TAP根管消毒效果值得肯定。

对于部分消毒不够完善的实验牙，推测主要是由于操作因素引起的：(1)建立CAP模型时根管内感染程度较严重，仅1次的TAP消毒不足以消灭细菌；(2)根管内注射TAP时未达到根管长度的2/3，或在根尖区形成气泡，对根尖区的消毒不够完善；(3)由于犬牙牙冠形态呈尖圆形，且磨除牙尖后临床牙冠短，较难使用橡皮障对牙齿进行隔离，为避免5.25% NaClO流入口腔刺激黏膜，故选用低浓度0.5% NaClO进行根管冲洗，从而降低了与TAP协同抗菌的效果。

针对以上问题，后期研究将进行以下改进：(1)当根尖X线影像分级达2级时即认为CAP建模成功，及时进行根管消毒；(2)根管消毒时采用注射器注射和螺旋输送器相结合的方式导入TAP，尽量减少产生气泡；(3)根管消毒时采用复合树脂暂时固定橡皮障的方法对犬牙进行隔离，并使用5.25% NaClO进行根管冲洗，增加与TAP协同抗菌的作用。

20颗实验牙共40个根管内均有的血管、类牙骨质、类骨以及类牙周膜等组织生成，与Zhu等的结果相似[18]。根管内新生组织可能来源于牙周膜、根尖区残留的上皮根鞘、牙囊细胞等。本研究是在构建了CAP模型的基础上进行牙髓血管再生术，上皮根鞘、牙囊细胞等可能都遭受不同程度的破坏。而牙周膜来源的细胞较广泛地分布于根管壁外侧区，数量大，且结构和功能都保存较为完整。且本研究中观察到类牙周组织(如类牙骨质、类骨、类牙周膜)由根管的外侧壁及根尖区向根管内部生长的趋势，因此推测根管内的新生物主要来源于牙周膜。

本研究将传统TAP中的米诺环素替换为头孢克洛进行根管消毒，不仅发生牙体变色的风险低，而且获得了良好的根管消毒效果，牙根继续发育。但结果仍需进一步的临床观察和验证。组织学发现根尖区新生的组织包含了类牙骨质、类骨以及类牙周膜等组织，而无牙本质的形成，与Wang等的结果相同[2,19-20]。是否能通过在刺激根尖出血形成血凝块的基础上添加生长因子或生物支架从而促进牙本质的形成，尚需进一步的研究和探讨。

[1]Iwaya S I,Ikawa M,Kubota M. Revascularization of an immature permanent tooth with apical periodontitis and sinus tract[J].DentTraumatol,2001,17(4):185-187.

[2]Wang X,Thibodeau B,Trope M,etal. Histologic characterization of regenerated tissues in canal space after the revitalization/revascularization procedure of immature dog teeth with apical periodontitis[J].JEndod,2010,36(1):56-63.

[3]陈敏,刘雪梅,包志凡,等. 犬年轻恒牙根尖周炎和再生性牙髓治疗后组织学观察[J]. 中国实用口腔科杂志,2015,8(9): 532-535.

[4]钟小奕. 年轻恒前牙感染根管内血管再生的动物实验研究[J]. 华西口腔医学杂志,2010,28(6):672-674.

[5]Belobrov I,Parashos P. Treatment of tooth discoloration after the use of white mineral trioxide aggregate[J].JEndod,2011,37(7): 1017-1020.

[6]Huang G T. A paradigm shift in endodontic management of immature teeth: conservation of stem cells for regeneration [J].JDent,2008,36(6): 379-386.

[7]Thibodeau B, Trope M. Pulp revascularization of a necrotic infected immature permanent tooth: case report and review of the literature[J].PediatrDent,2007,29(1): 47-50.

[8]S Huumonen D. Radiological aspects of apical periodontitis[J].EndodonticTopics,2002,1(1):3-25.

[9]文春媚,黄杨,陈文霞,等. 犬年轻恒牙血管再生法动物模型建立的影响因素[J]. 临床口腔医学杂志,2011,27(6):340-342.

[10]王雪梅,何临海,孟松,等. 常用根管消毒药物对犬牙根管内优势致病菌消毒作用研究[J]. 牙体牙髓牙周病学杂志,2012,22(4):238-240.

[11]Kettering J D,Torabinejad M. Investigation of mutagenicity of mineral trioxide aggregate and other commonly used root-end filling materials[J].JEndod,1995,21(11):537-542.

[12]Saad A Y. Calcium hydroxide and apexogenesis[J].OralSurgOralMedOralPathol,1988,66(4):499-501.

[13]Petrino J A,Boda K K,Shambarger S,etal. Challenges in regenerative endodontics: a case series[J].JEndod,2010,36(3):536-541.

[14]Boutsioukis C, Noula G, Lambrianidis T.Exvivostudy of the efficiency of two techniques for the removal of mineral trioxide aggregate used as a root canal filling material[J].JEndod,2008,34(10):1239-1242.

[15]Law A S. Considerations for regeneration procedures [J].JEndod,2013,39(3):44-56.

[16]Hoshino E,Kurihara-Ando N,Sato I,etal.In-vitroantibacterial susceptibility of bacteria taken from infected root dentine to a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline[J].IntEndodJ,1996,29(2):125-130.

[17]Windley W,Teixeira F,Levin L,etal. Disinfection of immature teeth with a triple antibiotic paste [J].JEndod,2005,31(6):439-443.

[18]Zhu X,Zhang C,Huang G T,etal. Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration[J].JEndod,2012,38(12):1604-1609.

[19]Chanda P M,Hegde K S,Bhat S S,etal. Tissue engineering in endodontics: root canal revascularization[J].JClinPediatrDent,2014,38(4):291-297.

[20]Silva L A,Nelson-Filho P,Silva R A,etal. Revascularization and periapical repair after endodontic treatment using apical negative pressure irrigation versus conventional irrigation plus triantibiotic intracanal dressing in dogs’ teeth with apical periodontitis[J].OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod,2010,109(5):779-787.

(编辑:张慧茹)

Pulp Revascularization of Dog Tooth Using Modified Triple Antibiotic Paste

ZHOU Ronghui1, CHEN Yuemin1, WANG Yumin2, TU Yuwang2, HUANG Xiaojing1

1.Department of Endodontics, The Affiliated Stomatological Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, China；2.College of Stomatological, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China

ObjectiveTo investigate the effects of modified triple antibiotic paste to pulp revascularization of dog tooth on tooth discoloration,root canal disinfection, and root continued development.MethodsFour 6-month-old Beagles were used and 30 premolar teeth were randomly selected from each dog premolar teeth as experiment teeth.20 teeth were used in the experimental group and to establish model of chronic periapical.Disinfecting the root canal with modified triple antibiotic paste, bleeding into canals was evoked by over-instrumentation into apical tissues with K-file allowing the formation of a blood clot and the coronal portions were sealed.Radiographs and H-E staining were performed to observe periapical radiolucent areas after 3 months.ResultsAfter 3 months, there were 4 teeth discoloration in 20 teeth.90% teeth had inflammation controlled.There were improvements of different degree in root canals periapical lesion healing, apical closure, and increases in length and thickness.ConclusionThe modified triple antibiotic has a lower risk on tooth discoloration, a good root canal disinfection and continued root development.

blood vessels/physiology； tooth； dental pulp； tooth root； periapical periodontitis； chronic disease； root canal irrigants； root canal therapy； disinfection

2015-12-23

福建省自然科学基金重点项目(2012Y0029)；福建省卫生系统中青年骨干人才培养重点项目(2014-ZQN-ZD-21)

1.福建医科大学 附属口腔医院牙体牙髓科，福州350002;

2.福建医科大学 口腔医学院，福州350004

周荣汇(1987-)，男，住院医师，医学硕士

黄晓晶. Email: hxiaoj@163.com

R322.41； R331.32； R781.05； R781.2； R781.3； R944.9； R978.1

A

1672-4194(2016)02-0121-05