蔗渣纤维素分解菌的筛选、鉴定及酶活的测定

黄惠娟，方界群，陈华文，陈迪文，黄 莹，黄振瑞，江 永*

（1广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316；2广东省遂溪县农业局，广东遂溪524300）

蔗渣纤维素分解菌的筛选、鉴定及酶活的测定

黄惠娟1，方界群1，陈华文2，陈迪文1，黄 莹1，黄振瑞1，江 永1*

（1广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316；2广东省遂溪县农业局，广东遂溪524300）

为充分利用蔗渣，筛选高效降解蔗渣的菌株，本文从堆肥中分离得到有显著透明圈、可产纤维素酶的真菌8株，选其中3株测定了羧甲基纤维素酶（CMCase）和滤纸酶（FPA）活性。结果表明，菌株SC8的透明圈直径、CMCase和 FPA活性均最大。经菌落形态特征分析，初步鉴定菌株 SC8属于曲霉属（Aspergillus）。相关性分析表明，所筛选菌株在纤维素透明圈直径的大小与CMCase、FPA酶活性成极显著正相关（p＜0.01）。

蔗渣；纤维素分解菌；纤维素酶；滤纸酶活

0　前言

蔗渣是制糖工业的主要副产品，是一种重要的可再生生物质资源。中国是仅次于巴西和印度的第3大甘蔗种植大国，南方蔗区甘蔗总产量7000多万t，蔗渣的产量达到700万t［1］。蔗渣的成分以纤维素，半纤维素以及木质素为主，蛋白质、淀粉和可溶性糖含量较少。由于蔗渣的木质化程度高、蔗茎表皮存在硅化细胞，养分不协调以及转化利用技术手段落后等原因，目前蔗渣多数被糖厂作为燃料提供锅炉热能，部分用于造纸和纤维板等，但其利用率和附加值低，不仅造成了资源的浪费，而且还带来了环境的污染。另外，甘蔗人工收获后蔗叶大部分被废弃于蔗田，干燥后大部分被农民焚烧（如不烧掉将影响下一季的生产管理），不仅浪费资源而且严重污染环境，如能通过技术手段使得在下一季甘蔗生产管理时蔗叶已经腐化，那么可以避免蔗叶被焚烧，而且蔗叶腐烂后能提高蔗田土壤有机质，改善土壤理化性质，提高土地生产力。虽然正在推广的甘蔗机械化收获能将蔗叶切断粉碎后回田，但蔗叶的纤维含量高，自然腐烂时间周期长，急需技术手段加速其腐化速度，从而为加快蔗叶回田推广速度奠定基础。

纤维素分解菌含有纤维素酶，可将蔗渣等纤维素分解为糖类，具有广阔的应用前景。但目前得到的纤维素酶，无论是来自动物、植物还是微生物，还不能满足大规模工业生产的需要［2］。纤维素酶活力较低，生产周期长，纤维素酶复合物的分子量十分庞大，单个酶组分没有水解纤维素的能力，菌株的纤维素酶活力仍然较低，这些原因一直是阻碍纤维素酶大规模生产应用的瓶颈问题［3］。因此，筛选分离得到理想的蔗渣纤维素分解菌，对于提高蔗渣养分资源循环高值化利用和解决环境污染问题具有重要意义。本研究综合利用羧甲基纤维素钠（CMC-Na）透明圈测定法和胞外酶活测定法，针对蔗渣纤维素降解问题，进行了纤维素分解菌的筛选和鉴定，并测定了其部分酶活力。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1纤维素分解菌分离样品

以蔗渣与鸡粪等自然堆肥材料为分离样品，当堆体温度上升到45℃时，采集中层样品于无菌器皿中，4℃保存备用。

1.1.2羧甲基纤维素钠培养基

羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 2 g、（NH4）2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、NaCl 0.5 g，蒸馏水1000 mL。制成固体平板培养基时加入琼脂20 g。

1.1.3试剂

0.05mol/L pH 4.8醋酸钠缓冲液；0.025 mol/L CMC-HAc缓冲液；DNS试剂（酒石酸甲钠22.75 g，3，5-二硝基水杨酸0.7875 g，氢氧化钠5 g，结晶酚0.625 g，无水硫酸钠0.625 g，搅拌溶解，冷却后定容至250 mL）；0.1％葡萄糖标准液。

1.2方法

1.2.1蔗渣纤维素分解菌的筛选、纯化及纤维素水解透明圈的测定

称取新鲜蔗渣堆肥物料20 g，放入盛有200 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振荡20 min。静置后吸取上层清液稀释成 10-1、10-2、10-3和10-4倍的菌液，各取200 μL分别涂布到羧甲基纤维素钠平板培养基上进行初筛分离，平板置于45℃恒温培养箱中倒置培养。待形成单菌落，分别挑取单菌落进行划线分离。将分离出的菌株点种到羧甲基纤维素钠平板培养基上，45℃培养3天。用1 g/L的刚果红染色10 min，再用1 mol/L NaCl冲洗，测量透明圈的直径。

1.2.2菌株复筛和粗酶液的提取

参照包衎等方法［4］，略有修改。取粗筛菌种在羧甲基纤维素培养基试管斜面上45℃活化3天。将5 mL无菌水滴加到试管斜面中。振荡，制备成菌悬液。吸取菌悬液1 mL接入25 mL CMC液体发酵培养基中，45℃、180 r/min震荡培养4天，所得发酵液经4℃、5000 r/min离心30 min，收集上清液作为粗酶液用于酶活力的测定。

1.2.3酶活测定

1.2.3.1葡萄糖标准曲线的制作

取 0.1％标准葡萄糖溶液分别制成 0.01％、0.02％、0.04％、0.06％和 0.08％的葡萄糖溶液。与DNS沸水浴5 min后取出冷却，加蒸馏水定容至6 mL混匀，以蒸馏水作为空白对照，测定各试管内的OD540值，以不同浓度的葡萄糖溶液作为横坐标，OD540值作为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

1.2.3.2羧甲基纤维素酶（CMCase）活力的测定

采用DNS法［5］，取0.5 mL上述粗酶液加入试管中，加入2 mL 0.025 mol/L CMC-HAc缓冲液，在45℃下酶反应30 min。试管中加入2.5 mL 3，5-二硝基水杨酸终止酶反应。充分摇匀后沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至15 mL。以变性酶为空白对照，测定 OD540值，代入葡萄糖标准曲线函数求得含糖量。

1.2.3.3滤纸酶活力（FPA）的测定

试管中加入0.5 mL粗酶液和2 mL 0.025 mol/L CMC-HAc缓冲液，于45℃水浴中预热5 min后加入50 mg滤纸条（新华定量滤纸，l cm×6 cm），保温1 h，加入2.5 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂终止酶反应。充分摇匀后沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至15 mL。以变性酶为空白对照，测定OD540值，代入葡萄糖标准曲线函数求得含糖量。

酶活定义为每分钟催化纤维素水解生成l μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU。按下式算出滤纸酶活力：

酶活=还原糖浓度×15×稀释倍数/（t×0.5×180）

式中，稀释倍数指测定酶活时酶液的稀释倍数；t为酶反应时间（min）；180为葡萄糖分子量，15指15 mL定容体积，单位为g；0.5指0.5 mL粗酶液参加反应。

1.3数据分析

所有试验数据均用Excel 2010和SPSS 17统计软件进行分析。

2　结果与分析

2.1蔗渣纤维素分解菌的筛选和鉴定

从蔗渣堆肥中经过刚果红透明圈法筛选分离到8株具有降解纤维素能力的真菌，依次命名为SC1～SC8（暂定名），其透明圈直径大小如表1所示。其中SC8菌株生长速度较快且长势旺盛，在刚果红培养基上形成的透明圈最大，降解纤维素的能力较强。该菌株在平板培养基上菌落呈圆形，边缘平整，具辐射状皱纹，质地丝绒状到絮状，表面粗糙，布满一层孢子粉，孢子呈暗绿色（图1 A），在刚果红纤维素培养基平板上能形成明显的透明圈（图1 B）。根据菌株的菌落形态特征，按《真菌分类鉴定手册》和《真菌分类学》进行检索，初步鉴定SC8为曲霉属（Aspergillus）。

表1　8株菌株的透明圈直径大小

图1　蔗渣纤维素分解菌的菌落形态（A）及在刚果红纤维素培养基上形成的透明圈（B）

2.2菌株羧甲基纤维素酶（CMCase）和滤纸酶（FPA）活力的测定

从表1中挑选出透明圈较大的菌株 SC2、SC6 和SC8进行羧甲基纤维素酶活力和滤纸酶活力的测定。从表2可见，菌株的CMCase和FPA酶活力由高到低依次为SC8＞SC2＞SC6，该结果与透明圈直径大小的结果相一致。SC8的CMCase和FPA酶活力分别为SC6的3.88倍和2.07倍。

2.3菌株透明圈和酶活力的关系

相关性分析表明（表3），菌株在刚果红纤维素培养基上形成的透明圈大小与CMCase和FPA酶活力成极显著正相关（p＜0.01），且CMCase和FPA酶活力之间也成极显著正相关。可见，通过菌株在刚果红纤维素培养基上形成的透明圈大小可初步判断其降解纤维素能力的强弱。

表2　菌株的CMCase和FPA酶活力

3　讨论

刚果红羧甲基纤维素（CMC）平板透明圈筛选法是目前分离纤维素分解菌公认的比较快速、简捷的方法。该法可用于识别产纤维素酶的菌株，还可用于初步判定酶活性高低。产酶越多，透明圈越大，产酶越快，透明圈出现越早。透明圈的大小与CMCase酶活、FPA酶活具有一定的相关性。岳思君等研究结果表明，水解圈的大小直接反映 CMC酶活的大小，但FPA酶活与刚果红纤维素平板水解圈大小、CMC酶活不成线性关系［6］。本文结果显示，所筛选分离得到的菌株透明圈的大小与CMCase酶活、FPA酶活存在极显著正相关。

表3　菌株透明圈与酶活力的相关性分析

近年来已发现的能降解纤维素的微生物超过了200种，但对纤维素分解能力较强的真菌主要归属于木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）和枝顶孢霉属（Acremonium）［7］。本文从蔗渣中筛选分离得到的真菌SC8经初步鉴定为曲霉属。钟国祥等［8］从霉变蔗叶中分离到1株纤维素降解菌，并对其培养条件和酶学性质进行了研究，结果表明该菌产酶的最适温度为为 40℃，最适 pH 为5.5。杨培新等［9］从长期堆放废弃竹笋壳的土壤中分离到1株产纤维素酶的曲霉属真菌，并且通过单因素试验从不同碳源、氮源浓度和培养基初始 pH 值3个因素优化了该菌在液体发酵中产纤维素酶的条件，结果表明，比未优化对照酶活力提高了15.02％。

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系。目前，认为纤维素酶由3种不同功能的水解酶组成：外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶［10］。研究表明，不同的微生物所产纤维素酶不同，多种微生物混合培养可以产生协同效应，明显提高纤维素的降解效率［11-13］。另外，影响酶活力的因素较多，如酶的浓度、底物的结构和性质、pH值、反应温度等［14-15］。本文从蔗渣堆肥中筛选得到8株纤维素分解菌，初步分析了其部分酶学性质，但菌株间的复合方式、相互作用以及发酵影响因素还有待进一步研究。

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（本篇责任编校：李金玉）

Screening， Identification and Enzyme Activity Assay of Bagasse Celluloytic Microbes

HUANG Hui-juan1， FANG Jie-qun1， CHEN Hua-wen2， CHEN Di-wen1， HUANG Ying1， HUANG Zhen-rui1，JIANG Yong1
（1Guangzhou Sugarcane Industrial Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery，Guangzhou 510316；2Guangdong Suixi County Bureau of Agriculture， Suixi 524300）

In order to make full use of bagasse， this study was conducted to screen high efficient bagasse degradation microorganisms from compost.8 strains of fungi with significant transparent circles and cellulase activity were screened and 3 of them were selected to determine the activity of carboxymethyl cellulase （CMCase） and filter paper activity （FPA）.The results showed that the size of transparent circle and the activity of CMCase and FPA of SC8 were the highest among the 8 screened strains.Based on morphology analysis， the fungus SC8 was initially classified into the genus of Aspergillus.Correlation analysis showed that the size of transparent circle was in significant positive correlation with the activity of CMCase and FPA （p＜0.01）.

Bagasse； Celluloytic microbes； Cellulase； Filter paper activity

S566.1

A

1005-9695（2016）03-0042-04

2016-04-14；

2016-06-13

南方高蓄能作物养分资源综合管理创新能力建设（2015B070701001）；南方高秆作物农用化学品减量化关键技术创新能力建设（2014B070706005）；现代甘蔗育种创新能力建设（2014B070705002）；国家现代农业产业技术体系甘蔗专项（CARS-20-3-1）作者简介：黄惠娟（1985-），女，助理农艺师，主要从事功能微生物筛选利用及科研管理等工作；Email：iue123@163.com

江永（1961-），男，硕士，研究员，主要从事甘蔗耕作与栽培、废弃物资源化利用等工作；Email：gz510316@sina.com

黄惠娟，方界群，陈华文，等.蔗渣纤维素分解菌的筛选、鉴定及酶活的测定［J］.甘蔗糖业，2016（3）：42-45.