一种糖蜜酒精酵母中长期保藏技术的研究

郭艺山，黄向阳，尚红岩，苏江滨，徐日益，高亚飞，邓文伟，康劲菊

(1广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316；2耿马南华华侨糖业有限公司酒精分厂，云南耿马677513；3云南力量生物制品(集团)有限公司，云南昆明650031)

一种糖蜜酒精酵母中长期保藏技术的研究

郭艺山1，黄向阳1，尚红岩1，苏江滨1，徐日益1，高亚飞1，邓文伟2，康劲菊3

(1广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316；2耿马南华华侨糖业有限公司酒精分厂，云南耿马677513；3云南力量生物制品(集团)有限公司，云南昆明650031)

主要介绍一种以改良甘油冷冻保藏法保藏糖蜜酒精酵母菌的技术。实验结果表明，利用改良甘油冷冻保藏法保藏菌株5年，酵母菌体形态及主要性质特征保持良好，且该法操作简便、经济有效，可满足糖蜜酒精生产菌种中长期保藏要求。

糖蜜酒精；酵母；菌种保藏；冷冻保藏法

0　前言

菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作，一个合理的保藏方法可以保持科研和生产所需的优良菌种性状。微生物的保藏原理一般是通过低温、干燥、隔绝空气等方法，降低微生物的新陈代谢，延长保藏时间。理论上，只要至少满足其中一个条件，就可以对菌种进行保藏。常用的微生物保藏方法主要有传代培养保藏、液氮超低温冻结保藏、真空冷冻干燥保藏、冷冻甘油保藏等[1-2]。

传代培养保藏法将菌种定期接种到适宜菌种生长的培养基上，待菌种生长完全后，通常置于4～6℃进行保存，每4～6个月移接1次进行移植培养。斜面接种传代保藏法是其最常用的方法，简单易行，且不要求任何特殊设备，可用于实验室中各类真菌的保藏。但是此方法易发生培养基干枯、基因突变、菌种污染等现象。同时传代培养法需要耗费大量的时间和人力，因此此法适用于少量菌种的短期保藏，不适宜大量菌种长期保藏。

冷冻保藏法是将菌种放入低温保藏的方法，可分为低温冰箱保藏法(-20℃、-40℃、-80℃)、干冰保藏法(约-70℃)和液氮保藏法(-196℃)。通过冷冻将真菌体内水分凝结，降低其代谢速度，达到长期保藏的目的[3]。一般而言，冷冻温度越低，效果越好，液氮中保藏的菌种存活率远比其他保藏方法高且突变发生率低。但在冷冻过程中会出现冻伤的现象，冻伤来源于 pH改变、缓冲液凝结、电解质浓度变化、细胞内结晶、菌体收缩等因素。低温过程中冰晶的产生可能会给细胞带来致命的伤害，所以在保藏过程中降温和解冻的过程是需要控制的，慢速的降温和快速的解冻可以得到较高的复活率。为了保藏结果更加优异，通常在保藏过程中加入一定的冷冻保护剂，比如甘油、海藻糖、二甲基亚砜(DMSO)等。据研究，冷冻保藏法，特别是液氮超低温保藏，存活率高，突变率低，保藏时间长，是世界培养物保藏协会推荐的方法之一，但是其缺点是培养物运输较困难，需要低温冰箱、液氮罐等特殊设备。

冷冻干燥保藏法使微生物在冷冻和真空减压的状态下，利用升华现象除去水分，微生物在非剧烈、避免细胞直接损伤的情况下处于干燥、缺氧状态，使细胞的新陈代谢减慢，从而达到长期保藏的目的[4]。冷冻干燥保藏法是菌种长期保藏最有效的方法之一，大部分微生物菌种可在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力，而且经冻干的菌种无需进行冷冻保藏，便于运输，但操作过程复杂，需要冷冻干燥机等设备。

目前公认较理想的菌种长期保藏方法是液氮冷冻保藏和冷冻干燥保藏[5]，但此类方法所需要的设备复杂，资金投入大。而当前国内的糖蜜酒精生产主要以中小型企业为主，多数不具备这些长期保藏菌种的条件。本文主要以目前多数糖蜜酒精生产企业的设备情况与环境条件为出发点，探索一种合适的且操作简易的中长期菌种保藏方法，解决企业对菌种稳定性的核心生产要求，以满足正常生产需求。

1　材料与方法

1.1材料

菌株：供试糖蜜酒精酵母菌Y-1，Y-2，由本研究室实验室保存。

糖蜜：82～87 °Bx，由广东徐闻三和发展有限公司提供。

40％甘油-生理盐水：将甘油和生理盐水按 4：6(v/v)比例均匀混合，高压灭菌，放置于4℃冰箱冷藏待用。

40％甘油溶液：将甘油和水按4：6(v/v)比例均匀混合，高压灭菌，放置于4℃冰箱冷藏待用。

平板或斜面培养基：2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母膏，2％琼脂粉，高压灭菌。

发酵培养基：32 °Bx糖蜜，pH4.0，0.2％尿素。

1.2方法

1.2.1冷冻保藏糖蜜酒精酵母方法

1.2.1.1普通甘油冷冻保藏法

将纯化的酵母菌接到斜面或平板培养基培养24～48 h，于无菌操作台用接种针刮取菌落直接接入装有1 mL灭菌的40％甘油水溶液的菌株保藏管中，制备若干数量保藏菌株，并做好标记，重悬，置于冰箱-20℃冷冻保藏。

1.2.1.2改良甘油冷冻保藏法

将纯化的酵母菌接到斜面或平板培养基培养24～48 h，于无菌操作台用接种针刮取菌落直接接入装有1 mL灭菌的40％甘油-生理盐水溶液的菌株保藏管中，制备若干数量保藏菌株，并做好标记，重悬，置于冰箱-20℃冷冻保藏。

1.2.2保藏方法效果评价

(1)不同保藏时间对菌株形态大小的影响：显微测微尺法[6]。

(2)不同保藏方式和时间对菌株发酵特性的影响：选取同一原始菌株进行4℃斜面保藏(半年转接1次)，-20℃甘油冷冻保藏，真空冷冻干燥保藏(有外送条件的机构进行真空冷冻干燥保藏)与-20℃甘油-生理盐水冷冻保藏，做对比试验，经发酵培养后分析成熟醪进行评价[7]。

(3)长时间保藏后菌株传代稳定性的影响：选取保藏60个月的菌株进行考评，将保藏菌活化后进行传代培养，对每一代菌株进行发酵培养，对发酵成熟醪进行测定评价[8-9]。

2　结果与分析

2.1不同保藏时间对菌株形态大小的影响

将甘油-生理盐水冷冻保藏不同时间的 2株糖蜜酒精酵母Y-1，Y-2菌株取样于显微镜下观察和测定细胞形态大小，每个样随机测50个细胞，取平均值。

结果如表1所示。不同保藏时期的2种酵母形态大小没有明显的变化，说明采用甘油-生理盐水长期保藏方式，对酵母菌株的形态大小没有显著影响。

表1　不同保藏时间对糖蜜酒精酵母菌株形态大小的影响

2.2不同保藏方式和时间对菌株发酵特性的影响

Y-1，Y-2菌株分别保藏 6、12、24、36、48、 60个月并定期对其进行发酵特性分析检验，记录并保存实验数据，统计分析结果如图1和图2所示。

图1　不同保藏方式和周期对Y-1菌发酵特性的影响

图2　不同保藏方式和周期对Y-2菌发酵特性的影响

分别将2株糖蜜酒精酵母菌Y-1，Y-2的甘油-生理盐水冷冻保藏菌(改良法保藏菌)、甘油冷冻保藏菌(甘油冷冻菌)、斜面保藏菌(斜面传代菌)及真空干燥冷冻保藏菌(冻干菌)接种到小三角瓶活化并进行扩培，离心去除上清液，取1 g左右酵母泥接入带有发酵栓的500 mL三角瓶(内装200 mL发酵培养基)，32℃培养72 h后，测定成熟醪含酒量。

由图1和图2可见，在中长期保藏周期5年内，真空冷冻干燥保藏法能够长期稳定地保持糖蜜酒精酵母Y-1，Y-2菌株发酵特性，是保藏条件允许下较好的菌株保藏方式。同时，甘油-生理盐水冷冻保藏菌亦表现出良好的发酵特性，且优于普通甘油冷冻保藏法，这可以表明生理盐水在菌株冻结过程中对细胞损伤有一定保护作用；而斜面转接菌株则出现一定程度的波动，在1年左右时间内斜面转接菌株能够保持较好的发酵特性，之后随着保藏时间的推移与转接次数的增加，发酵特性呈现退化的现象。综上可知，对糖蜜酒精酵母保藏的方式，短期可以选择斜面传代保藏方式，而真空干燥冷冻保藏与甘油-生理盐水冷冻保藏方式可适用于中长期保藏。

2.3保藏60个月后菌株稳定性试验

通过对甘油-生理盐水-20℃冷冻保藏60个月后的Y-1，Y-2菌株做稳定性试验，结果如表2所示。10代发酵试验中Y-1，Y-2菌株发酵产酒能力与残糖水平均表现出相对稳定的状况，同时对其显微镜检观察酵母形态，未见变形拉伸絮凝等退化现象，各代呈现的细胞形态较为均匀饱满。由此表明，甘油-生理盐水冷冻长期保藏后酵母细胞具有较好的传代稳定性。

3　结论

表2　甘油-生理盐水冷冻保藏60个月的菌株稳定性试验

通过连续5年对不同种糖蜜酒精酵母Y-1，Y-2菌株进行研究表明，菌种保藏短期可以选择斜面传代保藏方式，而真空干燥冷冻保藏与甘油-生理盐水冷冻保藏方式可适用于中长期保藏。其中甘油-生理盐水冷冻保藏方式能较好地保持菌种细胞形态，中长期保藏后的菌种依然保持良好的传代稳定性及发酵特性。同时，该保藏方法所需仪器设备及保藏条件要求不高，操作方法简易可行，可为多数企业在生产过程中避免因频繁转接而可能造成的菌种污染、衰老和退化现象，是比较适合中小糖蜜酒精生产企业采用的菌种中长期保藏方法。

[1] 吕红线，郭利美.工业微生物菌种的保藏方法[J].山东轻工学院报，2004，21(1)：52-55.

[2] 陈秀英.菌种保存方法的比较[J].中国卫生检验杂志，2004，12(2)：231-232.

[3] 顾金刚，李世贵，姜瑞波.真菌保藏技术研究进展[J].菌物学报，2007，26(2)：316-320.

[4] SMITH D, RYAN M J.The impact of OECD best practice on the validation of cryopreservation techniques for microorganisms[J].Cryo Letters, 2008, 29(1): 63-72.

[5] 周德庆.微生物学教程：第 2版[M].北京：高等教育出版社，2002.

[6] 顾国贤.酿造酒工艺学[M].北京：轻工业出版社，1996.

[7] 梁秉华，罗家骐.甘蔗糖蜜酒精生产检验方法[M].广州：轻工业部甘蔗糖业科学研究所，1986.

[8] 张沧桑，张渝，金良媛.无菌蒸馏水长期保藏酵母菌种的研究[J].啤酒科技，2004(8)：25-26.

[9] 徐日益，梁磊，郭艺山，等.耐高渗透糖蜜酿酒酵母的紫外诱变逐级驯化选育[J].甘蔗糖业，2012(6)：39-42.

（本篇责任编校：李金玉）

Study on Medium to Long-Term Preservation Technology of Molasses Alcohol Yeast

GUO Yi-shan1, HUANG Xiang-yang1, SHANG Hong-yan1, SU Jiang-bin1, XU Ri-yi1, GAO Ya-fei1, DENG Wen-wei2, KANG Jin-ju3
(1Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316;2Gengma Nanhua Huaqiao Sugar Co.Ltd., Gengma, Yunnan 677513;3Yunnan Power Biological Products (Group) Co.Ltd., Kunming 650031)

The improved glycerol freezing preservation method of preserving molasses alcohol yeast was introduced.The results showed that the morphology and main characteristics of yeast remained good after 5 years in the improved glycerol freezing preservation with simple operation and economical efficiency, which could satisfy medium and long term preservation requirements of molasses alcohol production strains.

Molasses alcohol; Yeast; Culture collection; Freezing preservation

TS249.3

B

1005-9695(2016)03-0038-04

2016-06-03；

2016-06-15

广东省科技计划项目(2013B010102002、2014A010107017、2016B070701005)；广东省科学院科研平台环境与能力建设专项资金项目(2016GDASPT-0208)

郭艺山(1984-)，男，工程师，研究方向：制糖综合利用与工业微生物代谢与调控

郭艺山，黄向阳，尚红岩，等.一种糖蜜酒精酵母中长期保藏技术的研究[J].甘蔗糖业，2016(3)：38-41.