引起老龄猫牙龈炎细菌分离培养鉴定

2016-09-20叶妍琳赵振江杨子江

中兽医学杂志 2016年4期

关键词：牙龈炎氏杆菌链球菌

叶妍琳，赵振江，杨子江，付　偲，杨　涛，肖　啸、2*

（1.云南农业大学动物科学学院，云南昆明 650201；2.云南农业大学动物医院，云南昆明650031）

引起老龄猫牙龈炎细菌分离培养鉴定

叶妍琳1，赵振江1，杨子江1，付偲1，杨涛1，肖啸1、2*

（1.云南农业大学动物科学学院，云南昆明 650201；2.云南农业大学动物医院，云南昆明650031）

∶牙龈炎是老龄猫发病机率较高的一种疾病，也是猫类健康危害较大的疾病之一，随着伴侣宠物市场的不断发展，老龄猫牙龈炎的病例也随之增多，因此，对于引起老龄猫牙龈炎致病菌的研究也显得尤为重要；通过采样拭子采集患牙龈炎的牙龈分泌物样本，分离到16株菌，通过菌落形态、菌体形态、生化特性，确定这16株细菌中有3种，分别是葡萄球菌、链球菌、阴性巴氏杆菌；引起老龄猫牙龈炎的致病菌是∶葡萄球菌、链球菌。

∶老龄猫牙龈炎；葡萄球菌；链球菌；分离培养；鉴定

1　引言

牙龈炎为牙龈部分组织发生的炎症，老龄猫牙龈发生时首先流涎最常见，最初有食欲，但咀嚼或吞咽出现障碍，进而食量逐渐减少，想吃但是不张嘴，逐渐消瘦，口臭明显［1］。局部淋巴结肿大，牙龈除血。打开口腔发现牙龈、牙床、口腔黏膜等部位红肿、溃疡并且出血等。严重病例常伴有全身症状［2］，如体温升高、精神沉郁、废食等。外观症状上，猫咪会应因为疼痛，而产生行为上的怪异，例如；易怒、具有攻击性、抑郁、喜欢独处、进食困难，不整理毛发（舔毛），当然口臭是最常见的现象。是老龄猫发病机率较高的一种疾病［3］。也是猫类健康危害较大的疾病之一。

近年来，随着伴侣宠物市场的不断发展，老龄猫牙龈炎的病例也随之增多［4］。猫的寿命较长，如果从小就能精心饲养管理，大多数的猫都能活14～17年（相当于人70～80岁）。猫在8～9岁时，开始进入老年期［5］，但它的衰老过程比较缓慢，衰老特征逐渐出现，只要主人细心观察就能发现。和人类一样，宠物也面临老龄化的问题，因此，对于引起老龄猫牙龈炎致病菌的研究也显得尤为重要［6］。

引起老龄猫牙龈炎的病因有很多种，其一是，老龄猫本身体质。抵抗力、免疫力就比较弱，细菌、真菌、病毒（猫杯状病毒、猫鼻气管炎病毒等）的侵入造成病变［7］，而一部分病因很可能是由潜在的疾病引起的，特别是老龄猫，慢性肾功能衰竭、白细胞减少症（下降的白血细胞数量）。另外，有极少数由糖尿病引致。虽然引起老龄猫牙龈炎的病因较多且复杂，但只要是细菌感染所致，如不配合采用抗生素治疗，病情反复机率很大［8］。虽然，理论上有很多药物能治疗猫牙龈炎，但随着抗菌药物的广泛使用以及临床中不合理使用药物，使得病原菌的耐药现象日趋严重，所以在日常饲养过程中应多注意它的活动和行为，发现异常，不要给它乱服药，应及时送宠物医院就诊服药一定要根据医嘱不要随意改变。

2　材料与方法

2.1试验时间、地点采集来自云南农业大学动物医院就诊时出现牙龈炎症状的老龄猫的牙龈分泌物，装予灭菌采样管中冷藏。2015年3月3日至2016年4月14日在云南农业大学动物科学技术学院牧医楼实验室进行室内试验。

2.2试验材料

2.2.1实验病料采集到的三只患牙龈炎的老龄猫的牙龈分泌物。

2.2.2主要仪器设备显微镜、托盘天平、锥形瓶、载玻片、盖玻片、气浴恒温振荡培养箱、恒温培养箱、超净工作台、酒精灯、立式压力蒸汽灭菌器、冰箱、台式高速离心机、接种环、染色缸、染色架等。

2.2.3培养基与试剂蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、乳糖、磷酸氢二钾、胆盐、普通肉汤培养液、血琼脂平板培养基、普通琼脂培养基、新型微生物微量生化鉴定管、革兰氏染液等。

2.3试验方法

2.3.1培养基（液）的制备参照参考文献［9］配制

2.3.1.1普通肉汤的制备∶蛋白胨2g；牛肉膏1g；氯化钠1g；加热溶于200ml双蒸水中，调节PH值为7.3-7.5，121℃高压灭菌15min备用。

2.3.1.2普通琼脂培养基的制备∶蛋白胨4g；牛肉浸粉1g；琼脂2.6g；加热溶于200ml双水中，调节PH值为7.3-7.5，121℃高压灭菌15min备用。

2.3.1.3血琼脂平板培养基的制备∶牛肉膏3g；蛋白胨10g；Nacl5g；琼脂15g；溶解于1000ml双蒸水中，PH调节到7.4-7.6，121℃高压灭菌15min备用。

2.3.2细菌的增菌在超净工作台上，用枪头滴管把配好的肉汤培养液分别取适量装入采好的病料高压灭菌的试管中，并且标明编号，然后置于恒温培养箱中37℃过夜培养24小时。

2.3.3细菌的分离接种环将过夜培养的肉汤培养液在超净工作台上分别接种到血琼脂平板培养基上，并且标明接种的编号。接种时用接种环以“Z”字型画开，每涂过培养皿的一半时旋转90°，用接种环继续沿“Z”字末端画开。接种完成后将培养皿放入37℃恒温培养箱过夜培养18h-24h。

观察菌落生长情况，长出圆形、中等大小、光滑、不透明、湿润的菌落，有不太明显的溶血环；微小灰白色半透明菌落。

2.3.4细菌的纯培养在超净工作台上挑取培养皿中挑取典型的单个无污染的菌落分别接种到普通肉汤培养基中，放入37℃恒温培养箱培养18h-24h，增菌培养，得到纯化的菌落。

并对在普通肉汤培养基上，纯化无污染的菌落进行革兰氏染色、镜检，疑似葡萄球菌、链球菌。

2.3.5细菌革兰氏染色、镜检

2.3.5.1制片取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚），干燥和固定。

2.3.5.2初染滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1～2min后倾去染液，水洗至流出水无色。

2.3.5.3媒染用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。

2.3.5.4脱色将玻片上残留水用吸水纸吸取，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色（一般20～30s），当流出液无色时立即用水洗去乙醇。

2.3.5.5复染将玻片上残留水用吸水纸吸取，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水晾干。

2.3.5.6镜检把制作好的玻片放在显微镜上，低倍镜找出细菌的范围，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置，从侧面观察并缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调节器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调节器转动至物象完全清晰为止。

2.3.6生化鉴定

2.3.6.1将纯化所得的细菌接种于营养肉汤中，恒温37℃培养18h-24h待用。

2.3.6.2细菌悬液的制取在无菌操作台上分别吸取4ml经过夜培养的肉汤菌液于经高压灭菌的离心管内，2000rmp离心20min，去上清液，加入1ml无菌生理盐水混匀。

凝固酶试验∶取肉汤培养物同凝固酶试验兔血浆于试管内充分混合，置37℃培养，6h后观察，如果内容物完全凝固，为阳性，液体不凝固为阴性。

马尿酸钠水解试验∶将细菌接种于马尿酸钠培养基中，37℃培养48h后，离心吸取上清液，加入氯化高铁立即混匀，10min后观察结果，振荡后沉淀物不消失为阳性，消失为阴性。

七叶苷水解试验∶将细菌接种于七叶苷培养基中，37℃培养48h后，观察结果。如果培养基变成黑色者为阳性，不变为阴性。

甘露醇、山梨醇发酵试验∶将细菌接种于对应的培养基中，37℃培养48h后，观察结果如果培养基变成黄色者为阳性，不变为阴性。

3　结果与分析

通过对来云南农业大学动物医院就诊时出现牙龈炎症状的三只老龄猫的牙龈分泌物细菌的培养、分离、染色镜检、生化鉴定，最后确定的细菌分别是葡萄球菌、链球菌。下面对实验结果进行分析∶3.1病原分离与培养在37℃培养的血平板上有溶血菌落、灰色圆形菌落和白色菌落（详见平板1、2、3），将纯培养的溶血菌落进行革兰氏染色，发现革兰氏阳性链球菌；将灰色圆形菌落进行染色，得到革兰氏阴性巴氏杆菌；将金黄色的菌落革兰氏染色，看到革兰氏阳性球菌，呈球形或稍呈椭圆形，排列成葡萄状。分离培养三份病猫样品时，分离得到疑似葡萄球菌8株，疑似链球菌5株，疑似巴氏杆菌3株，故做了生化鉴定，把三种细菌分为A、B、C两组讨论，A代表疑似葡萄球菌；B代表疑似链球菌；C代表疑似巴氏杆菌。详见图1、图2、图3.

血平板1　

血平板2

血平板3

3.2生化试验

3.2.1分离菌A生化试验

表1结果表明，试验菌株与判断标准相符，A菌为葡萄球菌；9］，共分离得到8株.

图1　疑似葡萄球菌　

图2　疑似链球菌

图3　疑似巴氏杆菌

表1　A菌生化鉴定结果

3.2.2分离菌B生化试验表2结果表明，试验菌株与判断标准相符，B菌为链球菌［10］，共分离得到5株。

表2　B细菌生化鉴定结果

3.2.3分离菌C生化试验∶与判断标准比较后，试验菌株与判断标准相符，因此C菌为阴性巴氏杆菌［11］，共分离得到3株，见表3.

表3　C细菌生化鉴定结果

与判断标准比较后，实验所分离培养到的菌株与葡萄球菌、链球菌、巴氏杆菌判断标准相符。结合细菌菌落形态和革兰氏染色镜检的结果，最后确定所分离到的菌为葡萄球菌、链球菌和阴性巴氏杆菌。

4　讨论

4.1引起老龄猫牙龈炎的病因有很多，在这里只是研究临床上最常见的细菌型，采样过程中发现随着年龄的增长猫患口腔炎的机率也大大增加，这可能是由于一些齿垢的积累损伤口腔黏膜，口腔免疫力下降，致使大量繁殖所引起，最终导致牙龈炎。不过齿炎口炎的发展过程，看法倒是较一致的，就是∶不当地方炎症反应。牙龈组织对牙斑（细菌和口水、食物的共同产物）产生不耐导致发炎。临床上观察到的牙龈口炎，一开始就发生在牙齿与牙龈之间，外观上可以看到红肿的患部。而细菌性牙斑如果继续与细菌交互作用，则会继续发展成牙结石，到了有结石阶段时，牙齿结构将受到破坏。

目前在牙龈口炎治疗上，倒是有一种较激进的处理方式，就是全口拔牙。猫咪齿龈和牙齿之间，如同水火，誓不两立，所以有些兽医会建议饲主，当猫咪发现有牙龈炎（牙齿和牙龈之间泛红）时，就做全口拔牙的动作，免得日后发生严重的口龈炎，这一点，我倒是采保留看法，理由∶拔牙不是轻松的工作！牙龈还很健康的猫，牙根也很健全，如果要拔牙，得做整套。切牙韧带会造成出血，用拔牙艇松动牙齿还是出血，加上猫嘴小、猫牙更小，拔牙艇不好操作。用拔牙钳拔出，又是出血、往往还没在拔牙钳上使力时，牙齿就应声断裂，残留的牙根又是一个祸根，高速电钻打磨也是出血。猫牙体积小是让猫咪拔牙难度升高的主因。

所以，对于猫的口腔问题，建议多在洗牙和口腔卫生上下手，口腔状况较差的猫，提醒饲主回诊的时间，定期的检查与清洁，必要时会拔除已经发炎较严重的牙齿，此时牙齿已经较好拔除，发炎的组织在拔牙后一个月内，也会得到很好的响应。当然，并不是每只猫，都可以在较优势的时间点，被发现牙龈有异状，所以有时候，当猫咪被送到诊所时，可能已经整个牙龈都红肿溃烂，有的案例甚至侵犯到较深的咽喉部，猫咪的痛苦可想而知。

4.2采样是在夏季，明显看得出的致病菌是葡萄球菌和链球菌，巴氏杆菌是阴性菌。可能不同的季节引起猫牙龈炎的致病菌有所不同。