20种中草药提取物对4种常见病原菌体外抑菌试验

2016-09-20宋志元孙雪峰张要齐

中兽医学杂志 2016年4期

关键词：猪链球菌氏杆菌黄连

吕　彪，宋志元，储　君，孙雪峰，张要齐*

（1.河南省新密市动物卫生监督所，河南新密452370；2.河南惠通天下生物工程有限公司，河南新郑451162）

20种中草药提取物对4种常见病原菌体外抑菌试验

吕彪1，宋志元2，储君2，孙雪峰2，张要齐*2

（1.河南省新密市动物卫生监督所，河南新密452370；2.河南惠通天下生物工程有限公司，河南新郑451162）

∶为了观察中草药对病原菌的体外抑菌效果，本试验采用水煎煮法提取大黄、黄连和黄芩等20种中草药活性成分，利用试管二倍稀释法分别测定中草药提取物对4种常见病原菌（猪链球菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌和大肠杆菌）的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。结果显示，大黄、黄连、黄芩、地锦草、石榴皮和白头翁等对大肠杆菌的体外抑菌效果较好，其中大黄和黄连的效果最好；大黄对巴氏杆菌的体外抑菌效果较好，MIC为62.5mg/ml；黄连、黄柏和白头翁对猪链球菌的体外抑菌效果较好，其中黄连的MIC＜1.95mg/ml，MBC为31.25mg/ml；黄连、黄柏、大黄和柴胡对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果较好，其中黄连和黄柏的MIC分别为3.91和15.6mg/ml。

∶体外抑菌；试管二倍稀释法；最小抑菌浓度；最小杀菌浓度

随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，肉类消费品的需求量大幅提高，畜禽养殖朝着规模化和企业化的方向发展。但由细菌引起的疾病对养殖业冲击很大，研究表明细菌是引起畜禽动物常见病和多发病的根源之一［1.2］，如大肠杆菌、猪链球菌、巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌等。目前，养殖行业对细菌性疾病的防治普遍使用抗生素及化学合成药物，导致了致病性细菌产生耐药性，细菌耐药性又加重了抗生素及化学合成药物的滥用，从而造成肉类食品药物残留加大，威胁着人们的健康。

在我国，中草药用于治疗动物疾病有着悠久的历史，与抗生素及化学合成药物相比，中草药具有不易使细菌产生耐药性，药物残留低，增强动物免疫力等优点［3.4］。随着人们对抗生素认识加深，越来越多的研究者把注意力转向了中草药。本试验旨在考察20种中草药提取物对大肠杆菌、猪链球菌、巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果，为中草药及其复方制剂治疗细菌性疾病方面的研究提供基础。

1　材料

1.1中草药板蓝根、柴胡、金银花、黄芩、黄连、黄柏、石榴皮、穿心莲、菊花、防风、地锦草、马齿笕、仙鹤草、白头翁、吴茱萸、龙胆草、大黄、鱼腥草、独活、香薷等，均购自河南省禹州市中药材批发行，所有药物经检定均符合生药质量标准。

1.2菌种猪链球菌、金黄色葡萄球菌和巴氏杆菌均购自中国兽医检查所；大肠杆菌由河南科技学院微生物实验提供。

1.3培养基液体培养基∶蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl10g，葡萄糖2g，加纯水1000ml，pH7.3±0.1。其中培养猪链球菌时，需添加5%胎牛血清。

琼脂培养基∶在液体培养基中加入1.5%琼脂。

1.4试剂和仪器酵母浸粉、蛋白胨和琼脂粉，葡萄糖和氯化钠。

蒸汽灭菌锅、酸度计、磁力加热搅拌器、电热恒温培养箱和超净工作台。

2　方法

2.1药液的制备精密称取每味中药各60g，加8倍量蒸馏水煎煮沸腾后改用文火煎1h，期间始终保持8倍量水，用4层纱布过滤∶残渣加6倍量水同法煎煮1h后过滤，合并两次滤液，减压浓缩至60ml，使其浓度为1g/ml。

2.2菌液的制备挑取一环斜面菌种，接种至普通肉汤培养基，37℃静置培养24h。用灭菌空白培养基校正菌液浓度，使活菌数为1～2×106 CFU/ml，备用。

2.3最小抑菌浓度（MIC）的测定采用试管二倍稀释法［5］测定药液对各供试菌的MIC。具体操作∶（1）取灭菌有棉塞试管11支，进行编号，编号后每管先加入与试验菌种对应的培养基2.0ml，然后于第一管中加入灭菌的受试药液2.0ml，混匀后取出2.0ml放入第2管中，依次作2-1～2-9的梯度稀释，直到第9管取出2.0ml弃去；第10管不加药液，作为阳性对照；第11管加受试药液2.0ml，混匀后取出2.0ml弃去，不加细菌，作为阴性对照，各管平行3份。（2）取细菌稀释液0.1ml分别加入上述1～10管中混匀，11号管加0.1ml灭菌生理盐水，注意每次移液要更换新的移液管，然后置各管于37℃恒温培养箱中培养18～24 h，观察结果。

2.4最小杀菌浓度（MBC）的测定挑取一环MIC终点浓度以上未生长细菌的各稀释管内培养物，划线于与菌种对应的琼脂培养基上，于37℃恒温培养箱培养18～24h，观察有无细菌生长，培养基中无细菌生长的最低浓度即为受试药液的最低杀菌浓度。

表1　20种中草药对大肠杆菌的体外抑菌试验结果（最小抑菌浓度和最小杀菌浓度）（mg/ml）

表2　20种中草药对巴氏杆菌的体外抑菌试验结果（最小抑菌浓度和最小杀菌浓度）（mg/ml）

3　结果与分析

3.120种中草药对大肠杆菌的MIC和MBC

表1显示了20种中草药对大肠杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，结合最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，结果表明大黄、黄连、黄芩、地锦草、石榴皮和白头翁等对大肠杆菌的抑菌效果较好，但也有差异。其中大黄和黄连对大肠杆菌的抑菌效果最好，MIC分别为15.63和31.25mg/ml，MBC分别为125和62.5mg/ml；黄芩、地锦草、石榴皮和白头翁次之。其它中草药对大肠杆菌的抑菌效果较差，其MIC和MBC均≥250mg/ml。

3.220种中草药对巴氏杆菌的MIC和MBC

表2显示了20种中草药对巴氏杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，结果表明大黄对巴氏杆菌的抑菌效果最好，MIC和MBC分别为62.5 和500mg/ml。黄连次之，MIC和MBC分别125和500mg/ml。其它中草药对巴氏杆菌的抑菌效果较差，MIC和MBC均≥250mg/ml，其中石榴皮、鱼腥草、穿心莲和吴茱萸对巴氏杆菌没有抑菌效果。

3.320种中草药对猪链球菌的MIC和MBC

表3显示了20种中草药对猪链球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，结果表明黄连对猪链球菌的抑菌效果较好，MIC＜1.95mg/ml，MBC为31.25mg/ml；黄柏和白头翁次之，MIC均为62.5 mg/ml，MBC均为500mg/ml；其它中草药对猪链球菌的抑菌效果较差，其中防风、柴胡、吴茱萸、黄芩、龙胆草、穿心莲、鱼腥草、金银花和大黄对猪链球菌没有抑菌效果。

3.420种中草药对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC

表4显示了20种中草药对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，结果表明黄连和黄柏对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC分别为3.91和15.6mg/ml，MBC分别为125和500 mg/ml；大黄和柴胡次之，MIC均为62.5mg/ml，MBC分别为250和500mg/ml；其它中草药的抑菌效果较差，其中板蓝根、吴茱萸、黄芩和防风对金黄色葡萄球菌没有抑菌效果。

表3　20种中草药对猪链球菌的体外抑菌试验结果（最小抑菌浓度和最小杀菌浓度）（mg/ml）

表4　20种中草药对金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验结果（最小抑菌浓度和最小杀菌浓度）（mg/ml）

4　结论与讨论

4.1本试验结果∶大黄、黄连、黄芩、地锦草、石榴皮和白头翁等对大肠杆菌的体外抑菌效果较好，其中大黄和黄连的效果最好；大黄对巴氏杆菌的体外抑菌效果较好，MIC为62.5mg/ml；黄连、黄柏和白头翁对猪链球菌的体外抑菌效果较好，其中黄连的MIC＜1.95mg/ml，MBC为31.25mg/ml；黄连、黄柏、大黄和柴胡对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果较好，其中黄连和黄柏的MIC分别为3.91和15.6mg/ml。

4.2以上试验结果说明很多中草药具有抑菌效果，但不同中草药对同一种菌的抑制效果不同，且同种中草药对不同菌也有不同的抑制效果。中草药的成分复杂，抑菌作用的机理和功能不同，其抑菌机制主要有［6］∶中草药有效成分直接破坏病原菌细胞膜和细胞壁，干扰细菌的代谢作用；中草药有效成分给机体提供营养，促进免疫器官的发育；中药可以减轻5-羟色胺、组胺的血管通透性作用，抑制细胞的溢出，同时能增强组织和器官的机能，从侧面达到抑菌的作用。

4.3本试验为体外抑菌，体外抑菌效果可能跟体内抑菌效果不同，需要进一步的验证，但有研究表明∶中草药可通过消除R质粒［7］，抑制β-内酰胺［8］，抑制病原菌的耐药性［9］等方式，避免病原菌产生耐药性，或对耐药菌有逆转作用。在我国，中草药用于养殖行业有着悠久的历史，利用中草药防治细菌性疾病，减少抗生素及化学合成药物的使用，将会降低药物残留对人们的危害，同时也能促进中医药现代化的发展。

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