送春与多花兰种间杂交后代的ISSR分析

周　丽， 胡春根

( 1. 华中农业大学 园艺林学学院， 教育部园艺植物生物学重点实验室， 武汉 430070； 2. 兴义民族师范学院， 贵州 兴义 562400 )



送春与多花兰种间杂交后代的ISSR分析

周丽1，2， 胡春根1*

( 1. 华中农业大学 园艺林学学院， 教育部园艺植物生物学重点实验室， 武汉 430070； 2. 兴义民族师范学院， 贵州 兴义 562400 )

该文使用简单重复序列间(ISSR)分子标记，对送春与多花兰种间杂交后代进行了研究。结果表明：从80个ISSR引物中筛选出14个扩增效果稳定的ISSR引物，对两亲本和59个F1代个体进行了ISSR扩增，得到107个扩增位点，扩增的片段大小位于90～2 100 bp之间，平均每个引物扩增7.64条条带，得到11种类型的带。ISSR标记在送春 × 多花兰的F1代中表现出一定的多态性，分离频率为44.86%，分离位点有83.33%符合孟德尔1∶1或3∶1的分离规律，产生偏孟德尔分离的位点占12.50%，余下的4.17%属于特殊分离带型。可能导致后代变异的位点为偏孟德尔分离的6条带、缺失的8条带或新生成的2条带。聚类图中父本和母本与F1代个体间的遗传距离较远，59个杂交后代先聚集成一组，再同母本相聚为一组，最后才同父本聚在一起，59个杂种均偏母本型。送春与多花兰的杂交后代在植株形态、染色体、遗传物质方面都具备双亲特点，61个个体间的ISSR分子量标记结果和植株形态学特征都说明，59个F1代杂种包含送春和多花兰的遗传特性是真杂种；F1代杂种既有双亲的互补特征带，又有双亲的重组片断即产生新的特异带，这说明送春与多花兰的杂交后代具有遗传变异的特点。该研究结果可以有效地对杂交后代进行定向选择，为兰花的杂交育种提供了分子依据。

送春, 多花兰, 种间杂种, ISSR分子量标记, 孟德尔分离, 聚类分析

送春(Cymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicum)，又名绿兰、春绿兰，为兰科(Orchidaceae)兰属(CymbidiumSW.)的重要观赏植物。送春开花时间2-4月，具花9～12朵，花香淡雅，在春兰花期过后的晚春时节送来缕缕清香。但送春花色不亮、叶薄革质、易外弯，欲改良这些性状，用多花兰(C.floribundum)与送春杂交，使相关性状互补，可选育出新的杂交品种。然而，由于国兰类经种子繁育的试管苗从栽培到开花所需时间较长。因此，通过对两亲本及F1代的分子标记， 探寻杂交后代的遗传规律，为其杂种后代的鉴定提供早期分子辅助选择依据。

ISSR分子标记是在SSR标记基础上发展起来的，现已形成成熟的技术，具有操作简便、重复性好等特点，可揭示比RFLP、RAPD、SSR更多的多态性，在遗传作图、基因定位、遗传多样性分析、进化、系统发育等研究方面被广泛应用(王健波，2002)。前人采用ISSR标记对多种物种的遗传多样性进行标记，如束花石斛(包音华等，2008)、华顶杜鹃(颜士辉等，2012)、夏蜡梅(汪琼等，2013)、太行菊(张世安等，2014)、油茶(考安都等，2014)。

1　材料与方法

1.1 材料

以送春为母本，多花兰为父本，得到杂交F1代果实，采用组培播种方法得到F1代59个个体(确保每个来源于一粒种子)，F1代材料直接从组培瓶中取出，两亲本取幼嫩叶片，所有备用材料在超低温冰箱保存。引物参照加拿大哥伦比亚大学公布的ISSR引物序列合成，购自上海生工；Taq酶、dNTP、Mg2+购自天根生化科技(北京)有限公司；Marker DL2000购自西宝生物公司。

1.2 方法

用改良CTAB法提取各材料总DNA。20 μL反应体系各组分的浓度分别为 1 × PCR buffer(不含Mg2+)，2.5 mmol·L-1Mg2+，0.25 mmol·L-1dNTPs，Taq DNA聚合酶1 U，引物 0.6 μmol·L-1， Template DNA 2.5 ng·μL-1，去离子甲酰胺2%。ISSR-PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min 1个循环；94 ℃变性35 s，47～58 ℃(依引物不同而不同)退火45 s，72 ℃ 延伸90 s 共40个循环；72 ℃保温10 min 1个循环，保存温度4 ℃。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶分离，TBE(1×)缓冲液，120 V电泳2 h，EB液染色10 min。

1.3 数据统计与分析

从扩增结果中选择多态性好的清晰条带进行分析，在电泳图谱中同位点上有条带的记为“1”，无带的记为“0”，建立(0，1)矩阵。用NTsys-pc2.02软件进行Nei’s遗传相似系数计算并UPGMA法构建聚类树状图，根据骆建霞和孙建设的方法进行分离符合度的卡平方测试。

2　结果与分析

2.1 ISSR引物的筛选

参考前人所使用的引物(高丽和杨波，2006)，从80条ISSR引物中筛选出扩增结果稳定、重复性强、条带清晰、多态性高的14条引物并优化退火温度(表1)。用这些引物对61份材料进行PCR扩增。

表 1　ISSR引物序列、最佳退火温度及统计位点数

Y=(C,T)

2.2 PCR扩增结果

14条ISSR引物总共扩增出107条带，每个引物平均扩增产生7.64条带，所得片段大小为90～2 100 bp，ISSR标记在两亲本和杂交子代中表现出多态性(图1)。

扩增结果可分为11种类型 (表2)，后代分离方式(表5)， 双亲共有型(两亲本和后代中全都有的带，这样的位点是两亲本共有且能在后代中完全遗传) ，这表明在两亲本中该位点以纯结合方式存在；偏父本型 (父本有母本无，后代中全有)，说明该位点在父本中是纯结合的，在后代中没有发生分离；偏母本型 (母本有父本无，后代中全有)，说明该位点在母本中是纯结合的，在后代中没有发生分离；以上3类带共计50条，占总带数的46.73%， 它们是在杂交后代中未发生等位基因分离的位点。缺失型带有8条，占总带数的7.48%，表现为双亲缺失型(两亲本有，后代中全无)、母本缺失型(母本有父本无，后代中全无)、父本缺失型(母本无父本有，后代中全无)，产生缺失型带，可能是染色体重组或断裂导致亲本特征谱带丢失。分离型带有47条，占总带数的43.92%，表现为母本分离型、父本分离型共、双亲分离型(两亲本有，后代中出现分离)，分离位点中，有38个符合孟德尔的分离中等位基因1∶1分离模式，有2个符合3∶1分离模式(表3)， 有6个偏离孟德尔遗传模式，分离方式既不是3∶1也不是1∶1，另有1个特殊位点在两亲本中均存在但是在交杂的F1代中，却有近一半的个体中有条带出现，属于特殊的双亲分离型。新生杂合型(两亲本无，后代中全有) 、新生杂合分离型(两亲本无，后代中分离出现)各有1条带占总带数的1.87%，2新增位点可能包含重组片断，这表明在F1代中可能产生新的变异。

ISSR标记在送春与多花兰杂交后代中表现多态性，并遵循呈孟德尔分离规律(表3)。ISSR为显性标记(有带为显性，没有带为隐性)，在杂交后代没发生分离的50条带型中，双亲共有标记有21条，有11条是父本特有标记，18条是母本特有标记，说明这些是没有发生遗传分离的位点，其杂交亲本的可能基因型组合为AA×AA、AA×Aa、Aa×AA、AA×aa、aa×AA五种类型之一；符合孟德尔分离的位点有40个，占总位点数的37.38%，其中符合1∶1分离比例的有38个位点，其亲本基因型可能为Aa×aa或aa×Aa，有2条符合3∶1分离比例，但父本为显性(有条带)母本为隐性(无条带)，亲本基因型无法推断；有6个单亲特有的位点，在后代中发生了偏孟德尔遗传分离，分离比例既不符合1∶1又不符合3∶1，细胞质遗传有可能导致扩增位点中产生不符合孟德尔遗传现象(表4)。

送春与多花兰杂交后代具备双亲的特征，ISSR分子标记结果和植株形态学特征都说明59个 F1代杂种包含双亲的遗传特性是真杂种；标记得到的位点分析结果表明，发生分离的位点母本特有标记要比父本特有标记多，不分离位点母本特有标记的也要比父本特有标记多，说明大多数杂种性状偏向母本；杂交后代不但保留着双亲的互补特征带，而且生成了新的重组片断带型，说明送春与多花兰的杂交后代既有遗传又有变异。

表 2　扩增结果统计

2.3 聚类分析

利用UPGMA法对两亲本及59个杂种进行ISSR聚类分析(图2)。从图2可以看出，59个杂交后代先聚集成一组，再同母本相聚为一组，最后才同父本聚在一起，59个杂种均偏母本型，表明了大多数杂种性状偏向母本。

用NTsys-pc2.02软件计算亲本与杂交后代的遗传距离和遗传一致度，F1代与送春的遗传相似系数在0.628 6～0.756 8之间，其中遗传相似系数大于0.7的有24个；F1代与多花兰的遗传相似系数在0.590 9～0.711 1之间， 其中大于0.7的仅有3个F1代个体；59个杂种间的遗传一致度高，在0.773 3～0.934 2间，聚类时最先聚在一起是杂种11号和26号，它们的遗传相似系数达0.934 2，为最高；两亲本间的遗传一致度最低仅为0.333 3。送春和多花兰的遗传距离为0.666 7为最远，两者在花朵数、花色、叶姿等方面存在明显差异，在F1代中容易表现出杂种优势。F1代的遗传特性介于两亲本之间，各个F1代个体间的遗传距离较小。

3　讨论与结论

在远缘杂交中，大多数杂种是偏母本性状的(陈瑞丹和张启翔，2004)。杂交育种时因重组而导致部分同源染色体间产生大量错配，使杂交后代保留大量重组体，接着重组分离和染色体断裂，导致染色体序列变化；细胞核与细胞质的相互作会也会影响基因组变化，杂交时为了达到核质平衡，细胞质会对外源核基因提供部分选择压力。偏父性遗传的基因主要位于线粒体基因组上，其原因是叶绿体基因组受到较严格的约束混杂的DNA量少，线粒体基因组混杂的DNA量比较多(戴思兰，2005)。

表 3　符合孟德尔分离位点的卡平方分析

表 4　偏孟德尔分离和两个特殊分离位点的卡平方分析

表 5　ISSR标记在送春×多花兰F1代的分离方式

送春属于兰属建兰组，地生兰，假鳞茎较小，叶8～16片，薄革质易弯垂，花9～12朵；多花兰属于兰属硬叶组，附生兰，假鳞茎较大，叶5～6枚，带形，坚纸质直挺，花无香味，10～40朵。父本和母本在植物学形态上差异很显著，其F1代种子萌发后不像地生兰一样形成根状茎也不像附生兰那样形成原球茎，而是形成类似根状茎的原球茎，并且分化后，在根茎以下部分仍然存有根状茎结构。F1试管苗栽培后大部分性状是趋母本的，在叶片宽度、叶片硬度、叶脉是否透明、有无叶关节、叶缘的情况等方面的表现介于两亲本之间，另外还有极少数叶尖有裂缺或叶缘白化形成叶艺的，可能是突变产生或是亲本祖先类型。

图 1　电泳照片　a. 引物 UBC857扩增结果; b. 引物UBC835扩增结果; c. 引物UBC818扩增结果; d. 引物UBC836扩增结果; M. 分子量标记; FP. 母本; MP. 父本; CK. 对照; 1-21. F1代小苗。Fig. 1　Photos of electrophoresis　a. Primer UBC857; b. Primer UBC835; c. Primer UBC818; d. Primer UBC836; M. Marker; FP. Female plant; MP. Male plant; CK. Negative control without template DNA; 1-21. F1 progeny plantlets.

图 2　亲本及杂种的ISSR聚类分析树状图FP. 母本； MP. 父本； 1-59. F1小苗。Fig. 2　Dendrogram for parent and hybrid progenies by cluster analysis(UPGMA)bases on ISSR markers　FP. Female plant; MP. Male plant; 1-59. F1 progeny.

偏孟德尔分离产生的原因可能是由于群体大小所致，但本实验所取样群体中的有个40位点卡平方分析结果表明符合孟德尔分离，可以排除群体因素造成的偏孟德尔分离；如果是由于染色体发生结构重排、缺失、插入和突变或双亲配子传递率的差异等原因造成偏孟德尔分离，则有可能产生突变，得到可选育新品种的新资源；如果是不同样本之间标记的清晰度差异引起的误差导致偏孟德尔分离产生，该位点则无效。缺失带型则有可能是染色体在杂交后分裂时发生了染色体缺失， 造成缺失带型的原因可能是由于双亲在染色体共线性上的差异导致形成“发卡”式结构而丢失，或是反转录转座子的激活等原因，具体原因有待进一步深入研究；新生带型发生的可能性是很小的，仅有2条，其产生的原因可能是染色体中插入新的片段或是染色体突变，可采用SRAP或SCoT标记进一步探究。

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ISSR analysis of interspecific hybrids descendants ofCymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicumandC.floribundum

ZHOU Li1,2, HU Chun-Gen1*

( 1.HuazhongAgriculturalUniversityCollegeofHorticulture&ForestryScience,KeyLaboratoryofHorticulturalPlantBiologyMinistryofEducation, Wuhan 430070, China; 2.XingyiNormalUniversityforNationalities, Xingyi 562400, China )

Interspecific hybrids descendants ofCymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicumandC.floribundumwere studied by using ISSR marker. Fourteen ISSR primers were selected from 80 ISSR primers, which were used to amplify 61 individuals including paternal, maternal and 59 F1 progeny, 107 DNA fragments were produced by using these ISSR primers to amplify, every primer had 7.64 bands in average. The length of amplified DNA fragments ranged from 90 bp to 2 100 bp, and there were 11 kinds of bands. The results showed that the polymorphism of ISSR marker in the F1 progenies was high, and the segregation locus was 44.86%. And 83.33% segregation loci accorded with the segregation patterns of Mendelian segregation model with the segregation ratio nearly 1∶1 or 3∶1. 12.50% segregation loci deviated from Mendelian segregation model, 4.17% segregation loci belonged to special bands. Six deviated from Mendelian segregation model bands, eight deficiency bands and two new genetic character bands would cause some new variation. Cluster analysis showed that the genetic distances of both parental and 59 F1 progeny is further, fifty-nine F1 progeny in one group, then fifty-nine F1 progeny and female plant were in one group, at last 59 F1 progeny and female plant and male plant were in one group, this result indicated that 59 hybrids were partial female type. The hybrids ofCymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicumandC.floribundumhad some common characteristics of their parents, such as leaves, chromosomes and hereditary material. Sixty-one materials were identified by ISSR markers and morphological characters that 59 F1 progeny obtained the genetic characteristics ofCymbidiumcyperifolimvar.szechuanicumandC.floribundum, so they were true hybrids. Fifty-nine F1 hybrids had mutually complementary bands of both parents, the F1 hybrids also produced some new specific bands which were recombinant fragment of parents. This experiment showed that 59 F1 progeny had both genetic and variation. Therefore, ISSR markers can be used as an effective molecular technique for directional selection of the interspecific hybrid and the study of orchid cross-breeding.

Cymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicum,Cymbidiumfloribundum, interspecific hybrid, ISSR markers, Mendelian segregation, cluster analysis

10.11931/guihaia.gxzw201412019周丽， 胡春根. 送春与多花兰种间杂交后代的ISSR分析 [J]. 广西植物， 2016， 36(8):949-955

ZHOU L, HU CG. ISSR analysis of interspecific hybrids descendants ofCymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicumandC.floribundum[J]. Guihaia， 2016， 36(8):949-955

2014-12-13

2015-02-29

贵州省教育厅项目 [2011(278)号] [Supported by the Program of Education Office of Guizhou Province 2011(278)]。

周丽(1978-)，女,贵州兴义人,硕士,副教授, 从事兰科植物保育与种质创新研究，(E-mail)zhouli@xynun.edu.cn。

*通讯作者： 胡春根，教授，博士生导师，主要从事果树重要经济性状相关基因克隆与转基因遗传改良研究，(E-mail)chungen@mail.hzau.edu.cn。

Q943，Q341

A

1000-3142(2016)08-0949-07