两个苏丹草品系成熟种子的组织培养和植株再生研究

李杰勤， 王丽华， 詹秋文， 胡能兵， 王世建

( 安徽科技学院 农学院， 安徽 凤阳 233100 )



两个苏丹草品系成熟种子的组织培养和植株再生研究

李杰勤， 王丽华， 詹秋文， 胡能兵， 王世建

( 安徽科技学院 农学院， 安徽 凤阳 233100 )

该研究以苏丹草品系S722和Sa的成熟种子为外植体、MS培养基为基础培养基，2，4-D和NAA各3个浓度共6个处理对这两个苏丹草品系成熟种子进行愈伤诱导，探讨不同品系在不同植物生长物质浓度及植物生长物质组合中诱导愈伤组织和继代培养以及分化的能力。结果表明：苏丹草S722和Sa成熟种子的愈伤诱导率差异不显著，平均诱导率为17.19%。诱导培养基中2，4-D浓度为0.5或1 mg·L-1时，诱导效果最佳，而添加NAA不能提高愈伤诱导率。在继代培养中，设定2，4-D和6-BA各两个浓度共4个处理组合，处理1(2，4-D 1 mg·L-1+6-BA 0 mg·L-1)的继代培养效果最佳。为了解不同植物生长物质对愈伤分化的影响，设定6-BA、NAA 各两个不同浓度、KT 3个不同浓度共5个处理组合对继代培养的愈伤进行分化培养。在5个处理中，处理1(6-BA 2 mg·L-1+NAA 0 mg·L-1+KT 0 mg·L-1)对S722成熟种子诱导的愈伤分化率最高，达33.3%。在这两个苏丹草品系中，S722更容易分化培养。综上结果表明，2，4-D浓度为1 mg·L-1时诱导愈伤和继代培养效果较好，6-BA浓度为2 mg·L-1时分化效果较好。另外，针对不同苏丹草品系进行组织培养和植株再生时，适当调整植物生长物质浓度能提高植株再生的成功率。

苏丹草， 种子， 组织培养， 植株再生， 植物生长物质

苏丹草(Sorghumsudanese)为禾本科高粱属一年生草本植物，原产于非洲的苏丹，因其饲草产量高，再生能力强，营养价值丰富，适应范围广等优点，在我国大部分地区都有栽种(詹秋文等，2001)。苏丹草是长江中下游地区最主要的夏季牧草，占该区域暖季型牧草种植面积在70%以上(徐玉鹏等，2003)。由于受夏季高温高湿影响，苏丹草在该地区种植时病害较重，影响其产量和品质。

转基因技术已成为育种的一种重要手段，而组织培养技术则是转基因技术的基础。因此，通过转基因技术来提高苏丹草的抗病性，将成为苏丹草抗病育种的一种新途径。目前，以组织培养技术为基础的转基因技术已经在水稻、玉米和棉花上得到了广泛应用(贾士荣等，2014；李娜等，2012；赵丹等，2013)。但与这些作物相比，通过组织培养获得高粱和苏丹草的再生植株则更难一些(Gurel et al, 2009；Liu & Godwin, 2012)。另外，组织培养技术在作物的种质保存方面也有重要应用(姚绍嫦等，2014；张卫华等，2014)。但苏丹草组织培养和植株再生的研究报道还较少。钟小仙等(2005)以苏丹草品系2098的幼穗为外植体进行组织培养，并获得了再生植株。王立艳等(2006)以苏丹草品系185成熟种子为外植体，研究了不同植物生长物质配比对愈伤组织诱导率的影响，但未获得再生植株。利用种子为外植体进行组织培养具有不受季节限制、取材方便的优点。但目前还未见以不同的苏丹草品系成熟种子为外植体，并获得再生植株的相关报道。本研究以本课题组培育的优质苏丹草品系Sa和S722种子为外植体，试图探明不同植物生长物质的组合对种子愈伤组织的诱导和分化以及植株再生能力的影响，为苏丹草的转基因育种和功能基因组学的研究奠定良好的基础。

1　材料与方法

1.1 材料与药剂

1.1.1 材料 本研究的材料为本课题组选育的苏丹草品系Sa和S722的成熟种子。1.1.2 药剂药剂NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MaSO4·2H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4· 5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、EDTA-Na2·2H2O、HgCl2、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、2,4-D、6-BA、NAA、KT等为分析纯。所配MS培养基pH值为5.6～6.0，蔗糖30 g·L-1，琼脂5 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 两个苏丹草品系Sa和S722成熟种子的灭菌处理分别取苏丹草品系Sa和S722成熟种子192粒，放在自来水下冲洗5～10 min。在超净工作台面上，先用70%酒精处理30 s(轻轻摇动)后倒掉酒精；再用0.1%升汞处理15 min，无菌水冲洗4～5次。将处理过的种子放入灭菌的小三角瓶中，加入1/3无菌水，放在振荡器上振荡12 h左右。

1.2.2 两个苏丹草品系Sa和S722成熟种子愈伤组织的诱导每个处理组合每品系接8瓶，每瓶2粒种子，接种时将种子横切为两半，即每瓶接4个半粒的种子进行成熟种子的愈伤组织诱导。基本培养基为MS培养基，用于愈伤组织诱导的植物生长物质处理组合见表1。接种2周后统计愈伤诱导结果和污染情况。培养的温度为25 ℃，光照10 h·d-1，光照强度1 500 lx，黑暗14 h·d-1。

愈伤诱导率 = 出愈伤组织的外植体个数/接种的全部外植体个数 × 100%。

表 1　苏丹草愈伤组织诱导的植物生长物质处理组合

1.2.3 两个苏丹草品系Sa和S722成熟种子诱导的愈伤组织继代培养接种2周后，对愈伤组织进行继代培养。继代培养的基本培养基为MS培养基，愈伤组织继代培养的植物生长物质处理组合见表2，每个品系接种8瓶。继代培养2周后进行结果统计，培养条件和愈伤组织诱导的条件相同。

表 2　苏丹草愈伤组织继代培养的植物生长物质处理组合

1.2.4 两个苏丹草品系Sa和S722成熟种子诱导的愈伤组织分化培养继代培养3周后，对继代培养的愈伤组织进行分化培养，每品系每个处理组合接5瓶。基础培养基为MS培养基，用于分化培养的植物生长物质处理组合见表3。培养温度为25 ℃，光照14 h·d-1，光照强度1 500 lx，黑暗10 h·d-1。

分化率=成苗数/接种数 × 100%

1.2.5 两个苏丹草品系Sa和S722分化苗的移栽当分化苗长到10 cm左右时，将其移栽到小营养钵中(根上的小块培养基不去除)，并加入适量的营养土。先将移栽的苗放在与分化培养相同温度和光照强度的培养箱中炼苗1周后，再放到室外培养1周，移栽到大田，并统计成活率。

成活率 = 成活苗数/分化苗数 × 100%

表 3　苏丹草愈伤组织分化培养的植物生长物质处理组合

1.3 数据统计与分析

数据统计与分析在Excel和DPS软件中完成。

2　结果与分析

2.1 两个苏丹草品系Sa和S722成熟种子愈伤组织诱导比较分析

从总体上来看，这两个苏丹草品系成熟种子的愈伤组织诱导率不高，平均为17.19%；而褐化率较高，平均达33.33%(表4)。这两个品系诱导出的愈伤组织颜色和特征基本相似，都是白色半透明、疏松质软，成不规则的块状(图1)。

6个处理之间愈伤组织形成率差异较大，最小的为处理6，平均为4.69%，而最大的为处理4，平均为21.88%。统计分析结果表明，这6个处理的愈伤组织形成率之间差异显著，但前5个处理之间差异不显著。这说明当2,4-D和NAA(萘乙酸)都为较大浓度时，苏丹草愈伤组织的形成率降低较明显。从以上结果看出，添加NAA不但不能提高苏丹草成熟种子愈伤的诱导率，在较大浓度时还会使诱导率降低。因此， 2,4-D对苏丹草成熟种子愈伤组织形成率起促进作用，而诱导培养过程中合适的2,4-D浓度为0.5或1 mg·L-1。

图 1　苏丹草品系Sa和S722成熟种子诱导的愈伤组织　A. Sa; B. S722。下同。Fig. 1　Callus induced from mature seeds of Sa and S722　A. Sa; B. S722. The same below.

表 4　两个苏丹草品系Sa和S722成熟种子诱导愈伤结果

注： 不同小写字母表示在0.05水平上显著。下同。

Note: Different small letters mean significant differences at 0.05 level. The same below.

另外，进一步比较这两个苏丹草品系的愈伤组织形成率则表明，两个苏丹草品系成熟种子的愈伤诱导率差异不显著。

2.2 两个苏丹草品系Sa和S722成熟种子诱导的愈伤组织继代培养的比较分析

为了解植物生长物质对愈伤组织继代增殖的影响，设定2种不同浓度的6-BA与2，4-D组合对愈伤组织进行继代增殖。结果表明，处理2(2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1)的效果很差，愈伤组织接种以后变为黄褐色，生长很慢(图2:A)。相反，处理1(2,4-D 1.0 mg·L-1)的效果较好，愈伤组织为淡黄色，质地疏松，增殖较快(图2: B)。这说明在增殖培养基中添加6-BA，对愈伤组织生长有抑制作用，并导致愈伤组织褐化。

2.3 两个苏丹草品系Sa和S722成熟种子诱导的愈伤组织分化培养结果的比较分析

从5个不同植物生长物质处理的结果来看，这5个处理都能使愈伤组织分化成苗，但不同处理组合的分化效果不一致。从分化的时间上来看，从出现绿点到芽的形成一般为4～9 d。这5个处理分化效果有较大差异，其中只有处理3能使这两个苏丹草品系都分化成苗。另外，在这5个处理中，只有处理5不能使S722分化成苗，而其它4个处理都能够使S722分化成苗。这说明相对于苏丹草品系Sa来看，S722更容易分化成苗。因此，对于不同的苏丹草品系其分化效果不一致，如S722处理1的分化率最高，达33.3%。综合看来，不同苏丹草品系对植物生长物质种类及浓度要求不同。如果需要达到最佳的分化效果，研究者应对不同的苏丹草品系愈伤植物生长物质浓度进行优化。

2.4 两个苏丹草Sa和S722品系再生植株的移栽分析

愈伤分化出苗1个月，对再生植株进行炼苗和移栽。结果表明S722的移栽成活率达65%，Sa的成活率则达75%。这说明再生植株能成活， 而且这两个苏丹草品系再生植株的成活率较高。

图 3　苏丹草品系Sa和S722分化成苗Fig. 3　Regenerated plants of Sa and S722

表 5　两个苏丹草品系Sa和S722成熟种子诱导的愈伤组织继代培养结果

3　讨论

苏丹草为高粱属草本植物，而高粱是公认的组织培养较困难的一种作物。目前，对于苏丹草组织培养的研究还较少，所选用的外植体只有成熟种子和幼穗。钟小仙等(2005)利用苏丹草幼穗进行愈伤诱导，诱导频率为80%～90%，诱导率较高。王立艳等 (2006) 利用苏丹草185的成熟种子进行愈伤诱导，诱导率最高为26.6%。在本研究中，苏丹草S722在2，4-D浓度为0.5 mg·L-1加NAA为0.2 mg·L-1的MS培养中的诱导率为31.25%，而Sa在2，4-D浓度为1 mg·L-1的MS培养基上的诱导率为25%。从上述可以看出，幼穗为外植体的诱导率远高于成熟种子，但成熟种子具有取材方便，在进行组织培养时不受季节限制的优点。本研究中，成熟种子诱导率较低，其主要原因是褐化率较高。因此，如何控制褐化来提高诱导率则需要更进一步的研究。

表 6　两个苏丹草品系Sa和S722成熟种子诱导的愈伤组织分化培养结果

苏丹草和所有高粱属植物一样，在组织培养过程中易褐化，褐化产生的酚类物质影响愈伤的生长，严重时导致愈伤死亡。吕宗友等(2011)研究表明，活性炭、Vc、PVP和AgNO3均能不同程度地降低褐化率。Wu et al(2014)对高粱的研究表明，丹宁含量较低的高粱材料其褐化率也较低。在本研究中，在继代培养和分化培养时，不同的植物生长物质处理也会造成愈伤组织褐化。例如，在继代培养中添加6-BA会造成苏丹草愈伤组织褐化。因此，在对高粱属植物进行组织培养中，适当的植物生长物质水平是需要考虑的一个重要因素。

高粱的组织培养研究表明，不同的高粱材料愈伤诱导率有较大差异，例如高粱Tx430就比较容易成功(朱莉等, 2011; Liu et al, 2014; Zhao et al, 2000)。本研究中，苏丹草S722和Sa在愈伤诱导率上差异不显著，但在最后的分化成苗则表现出较大的差异，S722更容易分化成苗。这说明，不同的品系之间在组织培养上有较大的差异。因此，选用更容易进行分化的材料，能更容易获得再生植株。本研究则表明S722比Sa更适合进行组织培养。

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Tissue culture and plant regeneration using mature seeds of two sudangrass strains

LI Jie-Qin, WANG Li-Hua, ZHAN Qiu-Wen, HU Neng-Bing, WANG Shi-Jian

(CollegeofAgriculture,AnhuiScienceandTechnologyUniversity, Fengyang 233100, China )

In the study, mature seeds of sudangrass strains S722 and Sa as explants were used to study the factors affecting callus induction, subculture and differentiation using different combinations of plant growth substances and MS (Murashige and Skoog) media for basic media. Six treatment combinations, including three different levels of 2,4-D and NAA, were used to induce callus from mature seeds of two sudangrass strains in callus induction process. The results showed that the percentage of callus induction was not significantly different between the two sudangrass strains. And the average percentage of callus induction was 17.19% for the two sudangrass strains. The proper concentration of 2, 4-D for callus induction was 0.5 or 1 mg·L-1in MS media. The percentage of callus induction did not changed when NAA was added in basic media in callus induction process. The results showed that it was not helpful for callus induction when NAA was added in MS basic media. Four treatment combinations including two different concentrations of 2,4-D and 6-BA were used to subculture for induced callus. The best combination was treatment No. 1, which included 1 mg·L-12, 4-D and 0 mg·L-16-BA. When 6-BA was added in MS basic media, callus became brown and the growth of callus was also inhibited. These results indicated that 6-BA inhibited the growth of callus in subculture process when 6-BA was added in MS basic media. To gain a better understanding about the effects of different combinations of plant growth substances in callus differentiation, five treatment combinations including two different 6-BA and NAA concentrations and three different concentrations of KT were used to differentiate for callus when the callus had been subcultured. Treatment No.1 was the best combination in the five treatment combinations. And the differentiation rate of callus from mature seeds of S722 was 33.3% when 2 mg·L-16-BA was added in MS basic media. It was the highest differentiation rate when the concentration of 6-BA was added in media. Callus from S722 mature seeds were more easily differentiated than the other sudangrass strain Sa. Summarily, the best concentration of 2,4-D for callus induction and subculture was 1 mg·L-1in basic media when mature sudangrass seeds were used for explants. 6-BA had inhibition effects for callus in subculture process. And the best concentration of 6-BA for callus differentiation was 2 mg·L-1in basic media. The different sudangrass strains should use different combinations of plant growth substances in tissue culture process. Therefore, plant regeneration rate would be improved if the concentrations and combinations of plant growth substances were adjusted in media for tissue culture and plant regeneration of sudangrass when different sudangrass strain’s mature seeds were used as explants.

sudangrass, seeds, tissue culture, plant regeneration, plant growth substances

10.11931/guihaia.gxzw201409050李杰勤， 王丽华， 詹秋文， 等. 两个苏丹草品系成熟种子的组织培养和植株再生研究[J]. 广西植物， 2016， 36(8):930-936LI JQ, WANG LH, ZHAN QW， et al. Tissue culture and plant regeneration using mature seeds of two sudangrass strains[J]. Guihaia， 2016， 36(8):930-936

2014-09-26

2015-03-24

国家自然科学基金(31301383)；安徽科技学院自然科学研究项目(ZRC2013371)；国家“星火”计划项目(2012GA710076)；安徽省省级学科建设重大项目—草学(皖教秘科[2014]28)；农业部科研任务专项(201503133)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31301383); Natural Science Research Program of Anhui Science and Technology Univesity(ZRC2013371)； National Spark Plan(2012GA710076); Anhui Key Program of Discipline ([2014]28); Special Fund for Scientific Research of Agricultural Ministry(31301383)]。

李杰勤(1980-)，男，四川屏山人，博士，讲师，主要从事饲草遗传育种研究，(E-mail) wlhljq@163.com。

Q943.1

A

1000-3142(2016)08-0930-07