黛黄芍药散对放射性直肠炎大鼠COX-2、TXB2及6-Keto-PGF1α的影响

王毓国　窦永起　秦丽



黛黄芍药散对放射性直肠炎大鼠COX-2、TXB2及6-Keto-PGF1α的影响

王毓国窦永起秦丽

目的通过动物实验，研究中药复方黛黄芍药散在抑制微血管血栓形成、改善肠道微循环方面对放射性直肠炎的作用机制。方法选用雌性Wistar大鼠60只，随机分为6组：空白对照组、模型组、地塞米松组及黛黄芍药散高、中、低剂量组，用60Co-γ射线单次盆腔照射制作大鼠放射性直肠炎模型，各组给予相应药物干预，在照射后第14天给药12小时后处死大鼠，取直肠进行免疫组化检测其环氧化酶2 (cyclooxygenase-2，COX-2)的表达，采用酶联免疫吸附试验检测各组血清中血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)、6-酮-前列腺素(6-keto-prostaglandin F1α，6-Keto-PGF1α)的浓度，并计算TXB2/6-Keto-PGF1α比值。结果照射后第14天，模型组大鼠COX-2、TXB2含量及TXB2/6-Keto-PGF1α比值明显升高，而黛黄芍药散各剂量组中上述指标明显低于模型组(P<0.01)。结论黛黄芍药散可有效抑制放射性直肠炎大鼠肠道微血管血栓生成，改善微循环，其作用机制可能是通过控制COX-2的表达，从而减少TXB2的合成与释放，进而调节TXB2/6-Keto-PGF1α比值。

黛黄芍药散；放射性直肠炎；环氧化酶2；血栓素B2；6-酮-前列腺素F1α

研究表明[1]，血小板增多及功能亢进易导致肠炎加重，其原因有两方面：一为血小板的激活、聚集促进微血管血栓形成，阻塞血管，导致微循环功能障碍，加重肠黏膜缺血缺氧，引起进一步损伤；另一方面血小板功能亢进导致更多炎症因子的释放，加速炎症反应，形成恶性循环[2-3]。其中环氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)、血栓素B2(thromboxane B2，TXB2) 及6-酮-前列腺素(6-keto-prostaglandin F1α，6-Keto-PGF1α)在血小板聚集、活化，血栓形成并加重炎症反应等整个炎症反应过程中具有重要作用。COX-2是将花生四烯酸催化合成TXB2和6-Keto-PGF1α的关键限速酶，能使炎症不断放大[4]。TXB2与6-Keto-PGF1α两者之间的动态平衡是调控血管壁紧张度、血小板功能及血管壁细胞迁移生长、止血及防止血栓形成和调节局部血流的重要因素。

课题组通过前期动物实验，证明了黛黄芍药散可减少核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及相关炎性信号因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-6(interleckin-6，IL-6)的表达，进而减轻炎症反应，本文以炎症反应的重要影响因素——微血管血栓形成为着眼点，探讨黛黄芍药散在抑制微血管血栓形成、改善微循环方面，对放射性直肠炎的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物

实验动物为清洁级Wistar大鼠60只，雌性，体质量180～220 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK-(军)2012-0004，动物饲养于光、暗各12小时,恒温、恒湿的安静饲养室内。1.2药物及给药方法

黛黄芍药散组方：青黛10 g、黄连10 g、黄柏10 g、牡丹皮15 g、赤芍20 g，血竭胶囊3 g，均购自中国人民解放军总医院中药房，经鉴定后，煎煮2次，经过滤、旋转蒸发、浓缩，按成人临床等效剂量(体表面积法折算)的1、2、4倍，分别配置成含中药0.68 g/mL、1.36 g/mL、2.72 g/mL的药液，4℃冰箱避光密封保存。取雌性Wistar大鼠60只，适应性喂养3天后，随机分为：空白对照组、模型组、地塞米松组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组10只。各组均于照射后次日开始灌胃，每天1次，连续14天。空白对照组、模型组均给予生理盐水10 mL/kg灌胃，地塞米松组给予地塞米松溶液1.2 mg/kg灌胃，中药低、中、高剂量组分别按相应浓度给予黛黄芍药散药液灌胃2 mL。

1.3实验仪器及试剂

60Co-γ照射装置(军事医学科学院放射医学与辐射防护医学研究所提供)，离心机(Sigma，1-15k)，OLYMPUS BX51显微镜，Image J1.48v图像分析系统。COX-2一抗试剂盒(博奥森，批号：bs-10411R)，二抗试剂盒(中杉金桥，批号：15155A09)，TXB2试剂盒(美国Andygene公司，批号：HTLL30420)，6-Keto-PGF1α试剂盒(美国Andygene公司，批号：HTLN30143)，3%戊巴比妥钠(德国，批号：k2208)。

1.4模型制备

各照射组大鼠于照射前8 小时禁食，除空白对照组外，其余组大鼠使用3%戊巴比妥麻醉，待大鼠肌肉完全松弛后，以仰卧体位将其四肢固定于特制照射板上，并置于距离60Co-γ源中心3 m、高1 m的照射台上，照射野自耻骨联合至肛门，照射野面积3 cm×4 cm，其余部位用厚5 cm的铅砖屏蔽。采用一次性照射，总剂量为30 Gy，剂量率165.32 cGy/min，照射时间为18分12秒，空白对照组大鼠置相似环境中，但不予照射，以造模后大鼠出现稀便、黏液便或柏油样便判定造模成功[5]，本实验造模成功49只，成功率98%。

1.5取材及标本处理

照射第14天给药12小时后，以3%戊巴比妥钠行大鼠腹腔麻醉，取血后剖取肛门以上3 cm直肠组织，沿纵轴剪开，生理盐水清洗净，肉眼观察其形态学变化。

1.6大鼠直肠COX-2测定

采用免疫组化法检测直肠组织中COX-2的表达。每张切片随机选取6个视野，显微镜下采集图像，并用Image J1.48v图像分析系统进行阳性显色的平均积分光密度测定，取其均值作为平均光密度数值。

1.7TXB2、6-Keto-PGF1α含量的ELISA法检测

于腹主动脉取血5 mL，滴入试管中，不抗凝，置室温静置2小时后，将其放入离心机中，4℃、3000 rpm，离心15分钟，取上清液，采用ELISA法测定血清中TXB2及6-Keto-PGF1α浓度。

1.8统计学处理

2　结果

2.1大鼠直肠肉眼观察比较

正常对照组：肉眼可见大鼠直肠表面光滑，纹理清晰，未见出血点、糜烂及溃疡。模型组：直肠皱壁形态不规则，充血明显，大量点状瘀斑形成，部分糜烂。地塞米松组：直肠黏膜中度水肿，肠壁增厚，偶见糜烂及溃疡。中药中剂量组：直肠形态欠规则，黏膜轻度水肿，肠腔变窄，少量溃疡形成。中药低、高剂量组：直肠黏膜结构较完整，点状瘀斑不明显。2.2黛黄芍药散对放射性直肠炎大鼠组织COX-2的影响

结果显示：直肠组织中COX-2表达主要位于细胞胞浆中，呈弥漫性的棕黄色颗粒，在空白对照组中表达量较少，而在各造模组中直肠组织炎症区域的细胞中表达更为明显。统计分析表明：与空白对照组相比，模型组COX-2表达量明显升高(P<0.01)；与模型组相比，各给药组COX-2表达量呈现不同程度的降低(P<0.01)，其中以地塞米松组、中药低剂量及高剂量组下降最为显著；各中药组与地塞米松组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1、图1。

表1　各组大鼠直肠COX-2的比较

注： 与空白对照组相比，aP<0.05，bP<0.01；与模型组相比，cP<0.01。

图1　各组大鼠直肠COX-2免疫组化检测结果(×400)

2.3黛黄芍药散对放射性直肠炎大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α浓度及其比值的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠血清TXB2浓度及TXB2/6-Keto-PGF1α比值明显升高(P<0.01)，6-Keto-PGF1α浓度明显降低(P<0.01)，提示放射性直肠炎可引起大鼠血清中TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α增高，6-Keto-PGF1α降低。与模型组比较，各给药组TXB2浓度均显著降低(P<0.01)，中药高剂量组最低，中剂量组次之，提示黛黄芍药散可降低放射性直肠炎大鼠血清中TXB2浓度；与地塞米松组比较，中药中剂量及高剂量组TXB2浓度均较低(P<0.05)，提示黛黄芍药散较地塞米松可有效降低放射性直肠炎大鼠TXB2水平。6-Keto-PGF1α浓度比较，各给药组与模型组比较差异不明显(P>0.05)。TXB2/6-Keto-PGF1α比值比较来看，各给药组均低于模型组(P<0.01)，以中药高剂量组最为明显，中剂量组次之，提示黛黄芍药散可有效降低放射性直肠炎大鼠血清中TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α水平。见表2。

表2　各组大鼠血清中TXB2、6-Keto-PGF1α浓度及其比值

注： 与空白对照组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.01; 与地塞米松组相比，cP<0.05。

3　讨论

正常条件下，直肠组织中COX-2含量较低，以维持机体正常生理活动。在病理过程中，NF-κB、PPAR-γ、TNF-α等多种炎症因子刺激下，COX-2表达增加，并将花生四烯酸催化合成前列腺素类物质，如血栓素A2(TXA2)、前列环素(PGI2)等，参与机体各种病理生理过程。TXA2和PGI2是一对重要的血管活性物质调节因子，在调节肠道微循环中有重要作用。其中TXA2可促进血管收缩、血小板内环腺苷酸的聚集和血栓形成，从而发挥止血作用。PGI2具有较强的舒张血管、抗血小板聚集和抑制血栓形成的作用[6]。TXA2与PGI2很不稳定，在血液中迅速水解为TXB2与6-Keto-PGF1α，两者相互拮抗[7]。在正常条件下，TXB2与6-Keto-PGF1α两者维持一定比例，在受到辐射损伤时，TXB2与6-Keto-PGF1α浓度产生异常变化，两者平衡失调，进而导致循环障碍、出血、血栓形成，引起肠黏膜微循环阻塞，加速炎症反应。

黛黄芍药散为临床经验方，由青黛、黄连、黄柏、牡丹皮、赤芍及血竭粉组成，具有清热解毒、凉血止血、燥湿止泻的功效。本实验表明，黛黄芍药散可有效减少放射性直肠炎大鼠COX-2和TXA2含量，平衡TXB2/6-Keto-PGF1α比值，且在降低TXB2水平方面，黛黄芍药散高剂量较地塞米松效果显著，在降低TXB2/6-Keto-PGF1α比值方面，黛黄芍药散高、中剂量效果与地塞米松相当。因此，推测其作用机制可能是通过抑制COX-2的表达，减少TXA2的合成与释放，从而调节TXB2与6-Keto-PGF1α比值，进而改善肠黏膜微循环，减轻炎症反应。

以往的动物实验主要集中于药物对炎症反应的直接影响，本实验着眼于炎症反应的放大因素——微血管血栓形成及其机制，从而为放射性直肠炎的研究提供新视角。

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[4]陈岳林，聂亚，方圆，等. 瘦素上调动脉内皮细胞环氧合酶-2及其产物的实验研究[J]. 现代生物医学进展，2016，16(4)：647-651.

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(本文编辑： 董历华)

Effect ofDaihuangShaoyaopowder on COX-2, TXB2and 6-Keto-PGF1αin rats with radiation proctitis

WANGYu-guo，DOUYong-qi，QINLi.

TraditionalChineseMedicineDepartmentofChinesePLAGeneralHospital，Beijing100853，China

Correspondingauthor：DOUYong-qi，E-mail：dyqi_301@yeah.net

ObjectiveTo explore the mechanism ofDaihuangShaoyaopowder on inhibiting thrombosis and improving the intestinal microcirculation in the rat model of radiation proctitis. MethodsSixty Wistar female rats were randomly divided into 6 groups, normal group, model group, dexamethasone group, high, mediumand, low dosage ofDaihuangShaoyaopowder groups. Rat models of radiation-induced proctitis were produced by60Co-γ ray radiation. The levels of COX-2, TXB2, 6-Keto-PGF1αand TXB2/6-Keto-PGF1αwere detected after drugs intervention for 14 days. ResultsCompared with the model group, the levels of COX-2, TXB2and TXB2/6-Keto-PGF1αwere obviously decreased in high dosage ofDaihuangShaoyaopowder (P<0.01). Compared with the model group,DaihuangShaoyaopowder groups could effectively reduce the level of COX-2,TXB2and TXB2/6-Keto-PGF1α(P<0.01). ConclusionDaihuangShaoyaopowder could effectively inhibit the formation of intestinal microvascular thrombosis, improve microcirculation, and the mechanism of action may be through controlling the expression of COX-2, which can reduce the synthesis and release of TXB2, and then adjust the ratio of the TXB2/6-Keto-PGF1 α.

DaihuangShaoyaopowder；Radiation-induced proctitis；Cyclooxygenase-2；Thromboxane B2；6-keto-prostaglandin F1α

全军后勤科研计划(AWS14C014)

100853北京，中国人民解放军医学院[王毓国(硕士研究生)、窦永起、秦丽(硕士研究生)]

王毓国(1991- )，2014级在读硕士研究生。研究方向：放射性直肠炎的基础与临床研究。 E-mail：wangyuguo301@163.com

窦永起(1965- )，硕士，教授，主任医师，博士生导师。研究方向：中医药治疗恶性肿瘤。E-mail: dyqi_301@yeah.net

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.09.003

2015-10-22)