血管性痴呆患者MTHFR基因多态性和血浆Hcy水平检测*

弓园芳，施梦丽，张　勤，崔　凯，陈淅泠#

1)郑州大学第二附属医院老年医学科 郑州 450014　2)郑州大学第二附属医院核医学科 郑州 450014



血管性痴呆患者MTHFR基因多态性和血浆Hcy水平检测*

弓园芳1)，施梦丽2)，张勤1)，崔凯1)，陈淅泠1)#

1)郑州大学第二附属医院老年医学科 郑州 4500142)郑州大学第二附属医院核医学科 郑州 450014

血管性痴呆；基因多态性；同型半胱氨酸；叶酸；维生素B12

目的：探讨血管性痴呆(VaD)与MTHFR基因多态性和血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平的关系。方法：选取73例VaD患者和75例非痴呆脑梗死患者，使用简易精神状态检查量表(MMSE)评定VaD患者痴呆严重程度。应用PCR-芯片杂交法测定其MTHFR基因多态性，酶循环法测定血浆Hcy水平，免疫分析法测定叶酸、维生素B12水平。结果：VaD组MTHFR基因TT基因型及T等位基因频率高于非痴呆脑梗死组(P<0.05)，MTHFR基因TT、CT型血浆Hcy水平高于CC型(P<0.001)；VaD组血浆Hcy水平显著高于非痴呆脑梗死组(P<0.001)，痴呆程度与血浆Hcy水平呈正相关(r=0.227，P=0.018);非痴呆脑梗死组叶酸、维生素B12水平高于VaD组(P<0.05)。结论：MTHFR基因C677T位点突变及高Hcy血症可能和VaD的发生相关。

血管性痴呆(vascular dementia，VaD)是继阿尔茨海默病后最为常见的一种痴呆类型，报道[1]称70岁以上人群的患病率高达1.5%。脑梗死、出血、低血流灌注及低氧耗脑损害等为VaD的主要病因，另外各种脑血管危险因素在该病的发病机制中也起关键作用[2]。血浆同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)升高是诱发VaD的一个独立的高危因素。N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是Hcy的限速酶，其C677T位突变可引起高Hcy血症。作者对VaD与血浆Hcy及MTHFR基因C677T位点突变的关系进行分析，报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 收集郑州大学第二附属医院老年医学科2013年9月至2015年5月住院的73例VaD患者，其中男40例，女33例，年龄65～90(76.8±7.1)岁；同期住院的75例非痴呆脑梗死患者75例，男45例，女30例，年龄62～87(76.5±6.9)岁。两组年龄、性别、教育程度、吸烟、饮酒等状况均衡，具有可比性。VaD及非痴呆脑梗死患者均符合1995年全国第4届脑血管病学术会议制定的各类脑血管病诊断要点，且脑卒中时间长于3个月。VaD组患者的选取还应符合NINDS/AIREN的“很可能痴呆”诊断标准和DSM-IV的痴呆诊断标准[3]，MMSE评分≤24分、HIS评分≥7分和CDR评分≥1分的患者。排除其他痴呆类型，如AD、LBD、PD等，排除各种严重心肺疾病、心源性脑栓塞、严重感染、肝肾功能异常、恶性肿瘤等疾病。

1.2痴呆严重程度评估 根据简易精神状态检查量表(mini-mental state examination，MMSE)评分将VaD组患者分为轻度、中度、重度3组。轻度痴呆组(20分≤MMSE评分<25分)30例，中度痴呆组(10分≤MMSE评分<20分)28例，重度痴呆组(MMSE评分<10分)15例。

1.3血清Hcy、维生素B12和叶酸检测 Hcy检测采用日立7600-020全自动生化分析仪及Hcy测定试剂盒(上海德赛诊断系统公司)，应用酶循环法测定Hcy浓度，≥15 μmol/L可诊断为高Hcy血症[4]。 血清维生素B12和叶酸检测采用美国贝克曼库尔特Uniceldxi800免疫分析仪及试剂盒(上海百傲科技有限公司)，应用免疫分析法测定。

1.4MTHFR基因检测采用PCR-芯片杂交法。抽取研究对象空腹肘前静脉血1 mL，提取血液基因组DNA。应用MTHFR基因检测试剂盒(上海百傲科技有限公司)进行PCR检测。PCR反应条件：50 ℃ 5 min;94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s;56 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。Bai O杂交显色试剂盒(上海百傲科技有限公司)反应B液10 μL与PCR扩增产物混匀成杂交液备用。已标记的MTHFR基因芯片放入全自动杂交仪片架中，加入190 μL杂交缓冲液和10 μL杂交液反应。应用Bai O基因芯片图像分析软件和MTHFR基因型分析软件分析。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0进行数据处理，对两组基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡检验。两组间叶酸、维生素B12、Hcy水平比较采用两独立样本t检验，3组不同痴呆程度患者Hcy水平比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，VaD组血浆Hcy水平与痴呆程度的关系采用Pearson相关分析。检验水准α=0.05。

2　结果

2.1MTHFR基因多态性 通过对芯片进行扫描，得到样品DNA与MTHFR(C677T)基因位点的野生型和突变型探针杂交形成的杂交图像，软件分析后，判断其基因型为CC(野生型)、CT(杂合突变型)和TT(纯合子突变型)(图1)。

A：CC基因型；B：TT基因型；C：CT基因型。图1　MTHFR基因型检测结果

2.2VaD组与非痴呆脑梗死组MTHFR基因型及等位基因频率分布VaD组和非痴呆脑梗死组基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=1.600和0.724，P=0.581和0.230)，具有群体代表性。2

组MTHFR基因型及等位基因频率分布比较见表1，VaD组MTHFR基因纯合子突变(TT)和杂合子突变(CT)发生率明显高于非痴呆脑梗死组，VaD组T等位基因频率也高于非痴呆脑梗死组。

表1　VaD组与非痴呆脑梗死组MTHFR基因型及等位基因频率分布　例(%)

2.2VaD组与非痴呆脑梗死组血浆Hcy、叶酸和维生素B12水平见表2。VaD组血浆Hcy水平明显高于非痴呆脑梗死组，叶酸水平明显低于非痴呆脑梗死组，而维生素B12水平低于非痴呆脑梗死组。

表2　VaD组与非痴呆脑梗死组血浆Hcy、叶酸和维生素B12水平比较

2.3VaD组痴呆程度与血浆Hcy水平的关系结果见表3。由表3可知随着Hcy水平升高，MMSE分值下降，痴呆程度加重。与轻度痴呆组比较，中度及重度痴呆组患者血浆Hcy水平均升高，差异有统计学意义；与中度痴呆组比较，重度痴呆组患者血浆Hcy水平也升高，差异有统计学意义；经相关性分析VaD组患者血浆Hcy水平与痴呆程度呈正相关(r=0.227，P=0.018)。

表3　VaD组痴呆程度与血浆Hcy水平的关系

*：与轻度痴呆组比较，P<0.05；#：与中度痴呆组比较，P<0.05。

2.4MTHFR不同基因型对血浆Hcy水平的影响

见表4，两组MTHFR基因TT型血浆Hcy浓度显著高于CT及CC型；两组CT型血浆Hcy浓度与CC型相比亦有显著性差异；两组不同基因型Hcy浓度比较为TT>CT>CC。

表4　MTHFR不同基因型血浆Hcy水平的比较

*：与同组CC型比较，P<0.001。

3　讨论

VaD是一种慢性进行性疾病，随着年龄的增加其患病率逐渐上升。Hcy是一种含巯基的氨基酸，是蛋氨酸循环脱甲基后的衍生物，参与体内的多种甲基化反应。研究[5]显示Hcy可损伤血管内皮细胞,促进血小板产生血栓素，诱导平滑肌细胞增殖, 促进动脉粥样硬化斑块。有研究[4]报道，血清Hcy每升高5 μmol/L，脑卒中发病风险增加59%；每降低3%，脑卒中发病风险则降低24%。另有研究[6]结果显示，轻度的Hcy 浓度升高与VaD和阿尔茨海默病均具有相关性，而VaD患者的血浆Hcy水平升高较AD 患者更为常见。该研究结果显示VaD组血浆Hcy水平显著高于非痴呆脑梗死组，提示血浆Hcy水平升高是诱发VaD的一个独立的高危因素。

血浆Hcy水平不仅受环境因素影响，与遗传也有关[7]，研究较多的是其与MTHFR基因多态性的关系。MTHFR是血浆Hcy代谢的限速酶，其活性降低可以导致Hcy在血液中堆积。人类位于染色体1p36.3的MTHFR基因整个编码区长1 980 bp，编码蛋白的相对分子质量为746 000，其氨基酸序列高度保守。MTHFR的基因型有多种，当编码该酶的基因在第677位发生错义突变时，由碱基T置换碱基C，产生TT基因型，使MTHFR酶活性下降，影响叶酸代谢，导致高同型半胱氨酸血症，与VaD的发病有关[8-10]。徐小红等[11]通过meta分析合并14个试验，结果示MTHFR基因C677T多态性的T等位基因可增加患VaD的风险。该研究结果显示，VaD组TT基因型及T等位基因频率明显高于非痴呆脑梗死组，两组MTHFR基因CT型和TT型血浆Hcy水平显著高于CC型，表明MTHFR基因C677T等位基因的突变可能是高Hcy血症发生的遗传因素之一，与国内外多项研究[9-10]相一致。

意大利一项针对健康老年人血浆Hcy 水平与认知的研究[12]发现，随着血浆Hcy 水平的逐渐升高，MMSE 评分逐渐降低。Hooshmand等[13]通过对274例非痴呆老年患者Hcy、叶酸、钴胺转运蛋白(维生素B12的生物活性片段) 及认知功能的7 a随访发现，Hcy、叶酸、钴胺转运蛋白与认知功能相关。该研究结果显示，VaD组血浆Hcy水平显著高于非痴呆脑梗死组，叶酸、维生素B12水平的检出率显著低于非痴呆脑梗死组，且VaD组血浆Hcy水平与痴呆严重程度呈正相关，表明高Hcy血症是老年认知功能障碍的危险因素。有研究[14]表明补充叶酸以降低Hcy浓度，可预防与年龄相关的认知能功能下降。

总之，MTHFR基因C677T位点突变及Hcy酸血症可能和VaD的发生相关。该研究属于回顾性分析，未能对研究对象进行补充叶酸、维生素B12的干预且样本量小、评价手段局限，需要扩大样本量进行进一步探讨。

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(2015-11-18收稿责任编辑李沛寰)

Detection of MTHFR gene polymorphism and plasma homocysteine levels in patients with vascular dementia

GONGYuanfang1)，SHIMengli2)，ZHANGQin1)，CUIKai1)，CHENXiling1)

1)DepartmentofGeriatrics，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500142)DepartmentofNuclearMedicine，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

vascular dementia;gene polymorphism;homocysteine;folate;Vitamin B12

Aim: To investigate the association between MTHFR gene polymorphism and plasma homocysteine(Hcy)levels in patients with vascular dementia(VaD).Methods: A total of 73 patients with VaD and 75 patients with nondemented cerebral infarction were recruited in the study. PCR-RFLP was used to analyze the polymorphism of MTHFR gene. The folic acid and vitamin B12 levels were measured using immunoassay method. And circulating enzymatic method was empolyed to test the Hcy concentration in plasma. The degree of dementia was classified according to the MMSE for patients with VaD.Results: The genotype TT and T allele frequency of MTHFR gene in VaD group were significantly higher than that in nondementia cerebral infarction group(P<0.05). The concentration of plasma Hcy was higher in patients with TT and CT type than those with CC genotype(P<0.001). Mean total plasma Hcy concentration was significantly higher in VaD patients than that in the patients with nondemented cerebral infarction(P<0.001), but the levels of folate and vitamin B12 were significantly lower in VaD patients than in the patients with nondemented cerebral infarction(P<0.05). The degree of dementia was positively related with plasma Hcy level(r=0.227，P=0.018).Conclusion: Genetic mutations of MTHFR C677T and the hyperhomocysteinemia may closely related to the occurrence of VaD.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.023

*河南省医学科技攻关计划项目201403095

，女，1964年4月生，硕士，主任医师，研究方向：老年痴呆，E-mail：13938289530@126.com

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