热处理对甜瓜的蔗糖和乳酸代谢网络通量的影响

王会松，庞广昌，刘婷婷（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300314）

热处理对甜瓜的蔗糖和乳酸代谢网络通量的影响

王会松，庞广昌*，刘婷婷
（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300314）

为了进一步了解采后热处理对果蔬在代谢方面作用的规律，寻找甜瓜在代谢水平上最适的热处理温度，本研究以甜瓜为材料研究热空气处理对其代谢网络通量的影响。将甜瓜放在45、50、55℃（阶跃式升温）下处理3 h后立即置于8℃下贮藏21 h，以8℃贮藏24 h为对照，得到甜瓜不同位置的糖酵解途径、TCA循环、蔗糖合成途径以及戊糖磷酸途径的代谢通量。结果显示：50℃处理组有较高的蔗糖和乳酸通量，用于热处理最为合适。本结果通过进一步研究热处理为提高果蔬的贮藏品质提供科学方法和理论依据。

甜瓜，热处理，蔗糖，乳酸，代谢网络，代谢通量

近年来将热处理应用到果蔬的贮藏保鲜越来越多。果蔬热处理是指对采后果蔬进行较高温度处理，处理温度一般为30～52℃，处理时间在几秒至几小时，对提高其贮藏品质有明显的帮助［1］。研究表明在果蔬采后经过适当的热处理之后，产生的热休克蛋白可以在后续的低温贮藏条件下被感应［2］，减少低温环境对机体造成的损伤，进一步提高果蔬在低温贮藏期间的品质。果蔬机体中某些代谢相关的酶的活性在经过热处理之后也会降低，从而在代谢水平上影响果实的贮藏［3］。有许多报道都证实了某些果蔬在经过热处理之后其贮藏品质得到提高［4-5］，但值得注意的是热处理具有潜在破坏性，使用不当即对果蔬造成变色、失水、热伤害等［4］，所以寻找到合适的热处理温度至关重要。

在果蔬的贮藏保鲜中，蔗糖和乳酸发挥着重要作用［6-8］。蔗糖在碳水化合物积累、交换、运输、分解与贮藏过程中发挥重要作用。甜瓜的糖代谢属于蔗糖积累型，果实中蔗糖代谢模式的差异将决定果实糖分积累的高低，并由此决定果实品质。乳酸和NADH+H+具有偶联关系，能够在细胞器、细胞和组织间穿梭［9］，这使它在调节多细胞有机体的细胞呼吸代谢、氧化磷酸化以及合成与分解代谢等方面发挥关键作用［10-11］，可见乳酸代谢通量实际上是反映呼吸和分解代谢的重要标志。在果蔬中，水分构成了果蔬不同组织在空间上进行物质和能量代谢的通道和联系，使得物质和能量的交流成为一个整体，从而实现了代谢途径和代谢网络贯穿于果蔬的不同空间位置，而不是只发生在细胞器或者细胞间［12］，这就类似于动物机体内是通过血液的流通来构成不同细胞和组织间代谢网络。物质和能量通过代谢网络在多细胞生物的不同空间组织间进行交换和传递［13］。本研究通过对蔗糖和乳酸代谢网络通量的研究，更能揭示果蔬在贮藏过程中机体的本质变化，以期为果蔬保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜瓜（Cucumis melo L.var.inodorus） 选取无损害，无病虫害，成熟度（均已达到商业成熟度）一致的优质的瓜。

3 K15高速冷冻离心机 美国Sigma公司；HVE-50哈雅玛高压灭菌器 日本Hirayama Manufacturing公司；SBA-40C生物传感器分析仪 山东省科学院生物研究所；Fluoroskan Ascent FL荧光-化学发光检测仪 美国Thermo公司；液氮、研钵。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 基于热处理对果蔬生理应答的方法［14-15］，对甜瓜进行空气热处理。具体步骤如下：将甜瓜放于气调箱（25 cm×43 cm×19.5 cm）中，气调比例［3］为5%O2＋2%CO2。采用微型实验冷库控制温度，将温度设置为45、50、55℃（高温处理采用阶跃式升温方式，对热处理效果更为有效且减少了对果蔬的损伤），高温贮藏3 h后立即转入8℃贮藏21 h，并且以8℃贮藏24 h作为对照。处理24 h目的是使其达到在该温度下的热力学稳态。每个温度设3个平行。取出后按甜瓜中间部位2 cm厚沿赤道平面切开，将甜瓜分为如图1的5个部分［13］，用液氮迅速冷冻，在冰浴条件下研磨，匀浆后全部转移入离心管，以10000×g、4℃离心10 min，收集上清液，并于-20℃条件贮藏。

图1 甜瓜部位分割图Fig.1 The segmentation map of melon

1.2.2 甜瓜蔗糖和乳酸代谢网络图的构建 基于已报道的代谢网络的研究方法及代谢网络的构建原则［16］，选择糖酵解、蔗糖合成途径、戊糖磷酸途径和TCA循环为主要代谢途径来构建蔗糖和乳酸代谢网络［3］。

图2 蔗糖、乳酸代谢网络图Fig.2 Sucrose and lactate metabolic network diagram

1.2.3 葡萄糖、蔗糖、乳酸和NADH浓度的测定 根据图2所建立代谢网络，需要求得的代谢速率共有12个（r1～r12），根据代谢通量的计算原则［16］，假设胞内中间途径代谢物处于拟稳态［在机体中胞内代谢物料平衡，这8个途径（表1）代谢物没有积累］，它们的质量平衡方程均为0，这样就可以得到8个约束向量。此时该系统的自由度F=4。而代谢网络中的NADH可通过实验测得，则总约束向量变为9。通过实验测定葡萄糖的变化速率r1、蔗糖变化速率r7、乳酸的变化速率r10，已知速率为4个，此方程可以得到唯一解（公式1），进而通过计算方程得到蔗糖和乳酸代谢网络的通量。

表1 甜瓜的质量平衡方程式Table1 Metabolic flux model equation

运用SBA-40C型生物传感器分析仪测定样品中葡萄糖、蔗糖和乳酸的含量，用于通量的计算。NADH的测定采用Fluoroskan Ascent FL荧光-化学发光检测仪，参考Schaefer等［17-19］的研究并进行了改进，其反应体系为（0.25 mmol/L HEPES/EDTA缓冲液，100 mmol/L KCl，10 mmol/L MgSO4，3 mmol/L 1，3-BPG，0.5 mmol/L DHAP，0.4 U/mL GAPDH）。

1.3 数据处理

使用Matlab 7.0软件以及SPSS软件进行了数据的计算，利用Visio 2007、Origin和Illustrator进行了相应的绘图。

2 结果与分析

2.1 甜瓜的蔗糖和乳酸代谢网络通量图

通过对测定的葡萄糖、蔗糖、乳酸和NADH的数据进行通量分析，利用Matlab 7.0数据处理软件得到归一化后的甜瓜蔗糖和乳酸代谢通量图（图中数据对应的先后顺序为：单一8℃空白组、45℃热处理组、50℃热处理组、55℃热处理组）。

2.1.1 甜瓜内果肉蔗糖和乳酸代谢网络通量图 如图3，在内果肉中，就葡萄糖-6-磷酸节点来看，经过热处理之后，进入磷酸戊糖途径的通量值都为负，而进入了蔗糖合成的途径通量较多。就丙酮酸节点来看，热处理之后乳酸合成通量都有所增加，但是以50℃热处理组最多；进入TCA循环途径的通量在经过热处理之后有所降低。对比乳酸合成途径通量和进入TCA循环途径的通量，可以看出无氧呼吸大于有氧呼吸，即在内果肉当中以无氧呼吸为主，并且经过热处理之后更倾向于进行无氧呼吸，这样更有利于蔗糖的合成。

图3 甜瓜内果肉蔗糖和乳酸代谢网络通量图Fig.3 Sucrose，lactate metabolic network flux in Melon pulp 3

2.1.2 甜瓜中果肉蔗糖和乳酸代谢网络通量图 如图4所示，在甜瓜中果肉当中，就葡萄糖-6-磷酸节点来看，经过热处理之后，进入磷酸戊糖途径的通量值都为负，而进入了蔗糖合成的途径通量较多，这一点与在内果肉中出现的情况比较一致，在整个果实当中，蔗糖更多的流向果实内部的果肉部分。就丙酮酸节点来看，中果肉的无氧呼吸强度大于有氧呼吸的强度，以无氧呼吸为主。

图4 甜瓜中果肉蔗糖和乳酸代谢网络通量图Fig.4 Sucrose，lactate metabolic network flux in Melon pulp 2

2.1.3 甜瓜外果肉蔗糖和乳酸代谢网络通量图 如图5所示，在甜瓜外果肉当中，由葡萄糖-6-磷酸节点可以看出进入磷酸戊糖途径的通量数值不再为负，而都是正值；四个处理组的蔗糖合成通量相差不大。由丙酮酸节点可以看出，经过热处理之后乳酸合成通量都较单一8℃空白组低，但是相差不大；并且与流向TCA循环途径的通量相比，在外果肉当中无氧呼吸仍然占据上风。

图5 甜瓜外果肉蔗糖和乳酸代谢网络通量图Fig.5 Sucrose，lactate metabolic network flux in Melon pulp 1

2.1.4 甜瓜内果皮蔗糖和乳酸代谢网络通量图 如图6所示，在甜瓜内果皮当中，由葡萄糖-6-磷酸节点可以看出，在经过50℃热处理之后进入蔗糖合成途径的通量较其他三种情况下的通量多，这种处理条件更适合蔗糖的合成，减少果实糖分的降解。由丙酮酸节点可以看出，内果皮部分的有氧呼吸强度大于无氧呼吸的强度；并且有氧呼吸的强度随着热处理温度的升高而加强，机体更倾向于增强分解代谢。

图6 甜瓜内果皮蔗糖和乳酸代谢网络通量图Fig.6 Sucrose，lactate metabolic network flux in Melon endocarp

图7 甜瓜外果皮蔗糖和乳酸代谢网络通量图Fig.7 Sucrose，lactate metabolic network flux in Melon epicarp

2.1.5 甜瓜外果皮蔗糖和乳酸代谢网络通量图 如图7所示，在甜瓜的外果皮当中，就葡萄糖-6-磷酸节点来看，经过45℃和50℃人处理之后进入蔗糖合成途径的通量较多，有利于果蔬的保藏；而经过55℃热处理之后，与内果皮一样，进入蔗糖合成途径的通量较单一8℃空白组的数值还要低，说明在果皮部位，经过如此高的温度处理之后反而对甜瓜起到了促进糖类物质分解的作用，有害于果蔬的保藏。就丙酮酸节点来看，甜瓜外果皮中有氧呼吸强度大于无氧呼吸，与内果皮的情况相类似，即甜瓜的有氧呼吸主要集中在果皮部位。

2.2 蔗糖代谢通量

糖分构成是影响果实品质的一个重要因素［20］，尤其是蔗糖。如图8显示，就整体数据而言，50℃热处理组的蔗糖通量较单一8℃空白组的蔗糖通量高，有三个部位（内果肉、中果肉和内果皮）呈现显著升高的趋势，分别较对照组高出了25%、21%和29%，所以经过50℃热处理之后更有利于蔗糖的合成，减少糖分的降解。经过45℃热处理之后，在内果肉部位有显著性升高的趋势，较空白组高出了28%，其他部位（即中果肉、外果肉、内果皮以及外果皮）也都有所升高，但是并没有呈现出显著性的变化。经过55℃热处理之后，在外果肉和果皮部位的蔗糖通量都要小于单一8℃空白组，可能如此高的温度已经开始扰乱了机体的代谢，使得甜瓜的糖分开始大量的分解消耗，从而会加速果蔬的损伤。由此可以看出，经过适当的高温处理确实会在抑制糖分分解方面起到好的效果，但是这也是有一定的高温上限。

图8 不同温度处理后甜瓜从内到外五部分的蔗糖通量Fig.8 The metabolic flux of sucrose in five parts of melon fruit under different storage temperatures

2.3 乳酸代谢通量

图9 不同温度处理后甜瓜从内到外五部分的乳酸通量Fig.9 The metabolic flux of lactate in five parts of melon fruit under different storage temperatures

乳酸的代谢通量可以定量化的反映果蔬呼吸代谢的受限情况和合成代谢的增强情况。如图9所示，就整体而言，经过50℃的热处理之后，在内果肉、内果皮和外果皮三个部位的乳酸通量较空白组都有显著的升高，尤其在内果皮和外果皮部位，分别高出了37%和53%，有效地抑制了呼吸代谢，并且为蔗糖合成的增强提供了帮助。经过45℃热处理之后，只有外果皮部位有显著性的升高，其他部位与空白组无较大差别。经过55℃热处理之后，甜瓜整体部位与空白组无较大差别。

3 结论与讨论

采后热处理可以提高果蔬的贮藏品质［1-2］。在果蔬的贮藏保鲜中，蔗糖和乳酸的研究对提高贮藏品质有着重要的作用［6-8］。较高的蔗糖合成通量有助于保持和增加果实的甜度，从而对果实的品质有极大的影响；乳酸通量可以定量化描述呼吸代谢的受限程度以及合成代谢的增强程度［3］，机体由于某些原因（如常规的低温贮藏或适当温度的热处理等）可以使呼吸代谢受到限制从而产生较多的乳酸，此时机体的分解代谢降低，更有利于延长果蔬的货架期；而乳酸又会通过由果实中水分所构成的复杂的代谢网络最终流向蔗糖合成途径，从而使合成代谢增强，进一步保证了果实的品质。通过对蔗糖和乳酸构成的代谢网络进行通量分析，更能从生命体（果蔬属于活体材料）最基本的代谢水平来揭示果蔬受到外部环境影响之后是如何做出响应的，以便为更好地寻找适合贮藏的最佳条件提供更为科学的理论和方法。甚至也可以拓展到借用果蔬作为操作体系进一步研究寿命的问题（延长寿命的本质就是最大限度的降低分解代谢）。本文以蔗糖和乳酸代谢网络通量作为研究方法，对甜瓜热处理的结果显示：经过50℃热处理之后蔗糖和乳酸通量总体较高，所以作为甜瓜热处理的温度比较合适，这与张辉等研究的最适热处理温度相一致［21-22］。

在对甜瓜进行不同温度贮藏的报道［23］中，蔗糖在高温区出现高通量时的温度（50℃）与本实验的热处理最佳温度是一致的。蔗糖是甜瓜果实含量最多且最为稳定的糖分，根据稀溶液依数性原理，蔗糖含量的增加有利于果实抵抗一定范围的高温胁迫；是果实为避免高温造成伤害的应激反应。从代谢的角度来看，随温度的升高所有催化中心代谢途径的酶活性都会增大，为了避免过高的代谢所引起的损伤，生物在高温应激的过程中只能通过降低呼吸和分解代谢途径中酶的转录与翻译来降低呼吸和分解代谢［3］，从而在后续的冷藏中进一步降低呼吸和分解代谢，达到提高贮藏质量和延长保鲜期的目的。

本研究对甜瓜在热处理（45、50、55℃）条件下的蔗糖和乳酸代谢通量进行了测定，并且绘制了甜瓜由内到外五个部位的蔗糖与乳酸的代谢网络通量图。结果表明，经过50℃的热处理之后更有利于增加蔗糖和乳酸的代谢通量，从而作为甜瓜保鲜的热处理温度最为合适。通过此次研究，期望进一步揭示果蔬在贮藏过程中机体的变化，为果蔬的热处理保鲜提供理论依据。

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Effects of heat treatment on melon in sugar and lactate metabolic network flux

WANG Hui-song，PANG Guang-chang*，LIU Ting-ting
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

In order to further understand the rule of heat treatment on postharvest fruits and vegetables in the metabolism，looking for optimum heat treatment temperature of melon on the metabolism.Melon was used in this study to reveal effects of metabolic network flux at heat treatment.The melon was placed in 45，50 and 55℃for three hours，then placed hami melon immediately in optimal storage temperature 8℃ under 21 hours，as a blank to 8℃for 24 hours，the metabolic flux of embden meyerhof pathway（EMP），pentose phosphate pathway （PPP），TCA cycle（TCA）and sucrose synthesis pathway（SSP）of hami melon fruit different spatial location at different temperatures were researched.The results showed that higher sugar and lactate flux appeared in the heat treatment group of 50℃.Thus，50℃ was the optimal heat treatment temperature.This result combined with early work，to summarize the influence of heat treatment on metabolism，with a view to provide a scientific method and theory on the heat treatment to improve the quality of fruits and vegetables.

melon；heat treatment；sugar；lactate；metabolic network；metabolic flux

TS255.1

A

1002-0306（2016）06-0314-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.055

2015－07－17

王会松（1990-），男，硕士研究生，研究方向：代谢工程，E-mail：master.whs@hotmail.com。

庞广昌（1956-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：pgc@tjcu.edu.cn。

国家自然科学基金面上项目（31371773）。