响应面法优化土党参多糖的提取工艺及其神经营养活性研究

张占军，杨小生（1.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002；2.扬州市职业大学生物与化工工程学院，江苏扬州225009）

响应面法优化土党参多糖的提取工艺及其神经营养活性研究

张占军1，2，杨小生1，*
（1.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002；2.扬州市职业大学生物与化工工程学院，江苏扬州225009）

对土党参多糖（CJP）的提取条件，分离纯化及其理化性质进行了研究，并研究了土党参多糖对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的分化作用。通过单因素实验及响应面优化实验，土党参多糖最佳提取条件确定为提取温度67℃、提取时间52 min和液料比17∶1 mL/g。通过DEAE-52纤维素柱层析分离，葡聚糖凝胶Sephadex G-100柱层析纯化，得到两种土党参多糖CJPH和CJPN。采用化学分析方法分析了土党参多糖的总糖、蛋白质、糖醛酸及硫酸基含量。通过高效液相凝胶渗透色谱法进行纯度鉴定和相对分子质量测定表明，CJPH和CJPN为均一多糖，其重均分子量Mw分别为3923 u 和7215 u。通过气相色谱法对其单糖组成进行了分析，采用红外光谱研究了其结构特征。通过PC12细胞培养表明，CJPH和CJPN均具有神经营养活性。研究表明，制备的土党参多糖能明显修复损伤的神经细胞，具有一定的开发利用价值。

多糖，响应面，优化，分离，纯化，理化性质，生物活性

土党参（Campanumoea javanica Blume）为桔梗科金钱豹属植物，又名野党参、奶参、白洋参、对月参、土参、柴党参、浮萍参、川人参等，多生于山坡草地、灌丛中。广泛分布于贵州松桃、遵义、毕节、兴义、织金等地苗乡以及我国南部和西南部分地区。民间以其根入药，有补气、止血、通乳的作用，用于虚劳内伤，肺虚咳嗽，脾虚泄泻，乳汁不多，小儿遗尿等症［1］。多糖作为一类碳水化合物，包括若干通过糖苷键连接的单糖，具有多种生物活性。近年来，由于其低毒性及广泛的治疗属性，如抗氧化［2］、抗肿瘤［3-4］、免疫调节［5-6］、抗炎［7-8］和降血糖［9-10］等活性，引起人们极大关注。土党参中多糖含量较高，其鲜品中多糖的含量可达16.40%～17.73%，经预处理后，热水浸提土党参多糖提取率可达28.05%［11］。此外，近年来对土党参多糖的药理研究表明，土党参多糖对小鼠脑缺血损伤具有保护作用［12］，且能够提高小鼠耐缺氧的能力［13］，以及具有改善小鼠学习记忆能力的作用［14］，并对小鼠具有抗疲劳作用［15］，因此具有较高的开发利用价值。

对土党参资源进行合理利用，本工作拟采用水煮醇沉法从土党参中提取水溶性多糖，并通过响应面法优化提取工艺条件，同时拟采用化学分析方法分析土党参多糖的总糖、蛋白质、糖醛酸及硫酸基含量，通过高效液相凝胶渗透色谱法进行纯度鉴定和相对分子质量测定，通过气相色谱法对其单糖组成进行分析，采用红外光谱研究其结构特征。并拟研究土党参多糖对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的分化作用，从而为土党参这一资源的进一步研究开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

土党参药材 购自贵州遵义，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为桔梗科金钱豹属植物土党参（Campanumoea javanica Bl.）；大鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞株 由中国典型培养物中心提供；马血清和小牛血清 购于美国Hyclone公司；神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF），DEAE-纤维素-52凝胶与Sephadex G-100 购于美国Sigma公司；牛血清白蛋白、葡萄糖醛酸、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、Pullulan等标准品 购于Sigma公司；其他所用试剂 均为分析纯。

H8453紫外可见分光光度仪 美国惠普公司；BRUKER-VECTOR22型傅立叶变换红外光谱仪 德国布鲁克光谱仪器；HP 1100高效液相色谱系统（配有示差折光检测器和数据处理系统） 美国惠普公司；GC-16型气相色谱仪 日本岛津公司；722S型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；HL-2B恒流泵与DBS-100A型自动部份收集器 上海沪西分析仪器厂；Alpha 1-2型冷冻干燥机 英国LABCONCO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 土党参经切碎烘干后粉碎，取过60目筛后粉末加90%乙醇回流提取2次，每次1 h，固液分离后，残渣经干燥得预处理土党参样品，保存备用。

1.2.2 土党参多糖的提取工艺流程 取预处理土党参样品10 g置圆底烧瓶中，加一定蒸馏水于特定温度下加热浸提一定时间，提取结束后离心（5000 r/min，10 min），收集上清液，残渣重复提取1次。上清液合并后减压浓缩至一定体积，加乙醇至最终体积分数为80%，5000 r/min离心10 min，沉淀物依次用无水乙醇、乙醚、丙酮各洗涤2次，干燥后即得土党参粗多糖（CJP）。

1.2.3 土党参多糖得率的计算 按以下公式计算土党参多糖得率：

多糖得率Y（%）=WE/WP×100

其中：WE为的粗提取物的质量（g）；WP为每次实验中使用的预处理样品质量（g）。

1.2.4 单因素实验 应用水提醇沉法提取土党参多糖，分别考察不同提取温度、提取时间和液料比对土党参多糖得率的影响。

1.2.4.1 提取温度对土党参多糖得率的影响 取预处理土党参样品5份，每份约10 g，各加蒸馏水200 mL，分别在50、60、70、80、90℃五个不同温度下，通过水浴锅加热搅拌提取45 min，各重复提取一次后合并滤液，制得土党参粗多糖后计算土党参多糖得率。

1.2.4.2 提取时间对土党参多糖得率的影响 取预处理土党参样品5份，每份约10 g，各加蒸馏水200 mL，在70℃下通过水浴锅加热搅拌提取，提取时间分别设置为15、30、45、60、75 min，各重复提取一次后合并滤液，制得土党参粗多糖后计算土党参多糖得率。

1.2.4.3 液料比对土党参多糖得率的影响 取预处理土党参样品5份，每份约10 g，分别加入蒸馏水100、150、200、250、300 mL，在70℃下通过水浴锅加热搅拌提取45 min，各重复提取一次后合并滤液，制得土党参粗多糖后计算土党参多糖得率。

1.2.5 响应面优化实验 根据单因素实验确定的各变量范围，采用Design-Expert软件，进行三因素三水平Box-Behnken实验设计，表1列出了各因素的实验水平及编码。根据单因素实验确定的各变量范围，选取提取温度（A）、提取时间（B）和液料比（C）3个因素作为响应变量，以土党参多糖得率为响应值，利用Design-Expert 8.0.6 Trial软件按照Box-Behnken原理进行响应面设计，优化土党参多糖提取工艺，以1、0、-1分别代表自变量的三个水平，实验因素及水平编码如表1所示。

表1 Box-Behnken响应面实验设计因素和水平表Table1 Variables and levels in the three-level，three-variable Box-Behnken experimental design

1.2.6 土党参粗多糖的分离纯化

1.2.6.1 土党参多糖的DEAE-52纤维素柱色谱 采用DEAE-52-纤维素交换柱色谱法对土党参粗多糖进行初步分离纯化，按照已经报道过的方法［16］。

1.2.6.2 土党参多糖的葡聚糖凝胶色谱法纯化 经DEAE-52纤维素初步纯化的产品用葡聚糖凝胶Sephadex色谱柱法进行进一步纯化。

1.2.7 土党参多糖的基本理化性质分析

1.2.7.1 总糖含量测定 样品均经过预处理，其中单糖及寡糖含量已甚微，所以再测定还原糖意义不大，故本实验直接采用苯酚-硫酸法测定总糖含量。

1.2.7.2 蛋白质含量测定 多糖样品中蛋白质含量的测定，采用Zhang等［17］报道的考马斯亮蓝法并略作修改。

1.2.7.3 糖醛酸含量测定 多糖样品中糖醛酸含量的测定，采用Wang等［18］报道的硫酸-间羟联苯法略作修改。

1.2.7.4 硫酸基含量测定 多糖样品中硫酸基含量的测定，参照Zhang等［17］报道的氯化钡-明胶比色法并略作修改。

1.2.7.5 纯度鉴定及相对分子质量测定 多糖样品的纯度鉴定和相对分子质量测定，参照Ma等［19］报道的高效液相凝胶渗透色谱法（HPGPC）稍作修改。色谱柱：PL aquagel-OH MIXED（7.5 mm×300 mm，8 μm），柱温25℃，示差折光检测器，流动相为NaAc-HAc/ water，流速1.0 mL/min，进样量50 μL。

1.2.7.6 单糖组成分析 多糖样品的单糖组成分析，参照Zhang等［17］报道的糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱法稍作修改。色谱柱：OV-275色谱柱（0.32 mm×20 m）；升温程序：120℃保持1 min，以20℃/min升至240℃，保持4 min；气化室温度260℃，检测器温度260℃，载气（N2）流速3.0 mL/min，进样量0.5 μL。

1.2.7.7 红外光谱分析 多糖样品的红外光谱分析参照Chien等［20］报道的KBr压片法，在傅立叶红外光谱仪VECTOR22上进行。称取2 mg左右经P2O5干燥的多糖样品，与已干燥的适量KBr粉末在玛瑙研钵中充分研磨均匀，用压片机压成薄片，进行红外光谱测定，扫描范围为4000～500 cm-1。测定样品前用不加多糖样品的KBr薄片进行背景基线扫描。

1.2.8 土党参多糖神经营养活性研究 土党参多糖对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的分化作用按照Deng［21］和Zhang［22］等报道的方法略作修改。

1.2.9 数据统计分析 所有数据都以平均值（mean）±标准差（sd）表示，应用IBM公司SPSS 22.0软件进行数据处理。采用单因素方差分析（ANOVA）进行差异显著性分析，p＜0.05认为具有显著差异。

2 结果与讨论

2.1 土党参粗多糖的提取

土党参根经粉碎、回流除杂、热水提取、乙醇沉淀、离心、冻干，可得到灰白色粉末状固体，即土党参粗多糖提取物。

2.2 土党参多糖提取工艺条件的选择

2.2.1 提取温度对土党参多糖得率的影响 不同提取温度对土党参多糖得率的影响，结果见图1。

图1 提取温度对土党参多糖得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on yield of CJP

由图1可知，不同提取温度对土党参多糖得率有较大影响。在一定提取范围内，土党参多糖得率随着提取温度的升高而增大，提取温度在70℃时土党参多糖得率达到最大值，但此后，随着温度的上升，多糖得率变化趋势不大，其原因可能与多糖本身的稳定性有关，高温浸提可能会导致土党参多糖的降解，从而引起多糖得率的降低。综合考虑，选择70℃为最佳土党参多糖提取温度。

2.2.2 提取时间对土党参多糖得率的影响 不同提取时间对土党参多糖得率的影响，结果如图2所示。

图2 浸提时间对土党参多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on yield of CJP

图2表明，随着提取时间的延长，土党参多糖得率逐渐增大，这可能是随着时间的延长，细胞破裂程度加大，从而使土党参多糖更好的溶解到水中，多糖得率增大。但超过45 min之后，得率增加不明显，而且时间延长还可能使多糖的结构发生变化，综合成本方面考虑，最佳提取时间选择在45 min。

2.2.3 液料比对土党参多糖得率的影响 不同液料比对土党参多糖得率的影响，结果见图3。

由图3可知，液料比较小时，土党参多糖得率有一些偏低，可能是因为溶剂量少使得物料变得粘稠，从而影响了多糖得率；液料比较高时得率较高，但液料比超过20∶1 mL/g后差异不显著，同时由于溶剂量大使得后续处理不便。因此，综合考虑，选择液料比20∶1 mL/g为实验中心点。

2.3 响应面实验优化

2.3.1 实验设计与结果 响应面优化具体实验设计方案及结果见表2，设计了17个实验点的响应面分析实验，其中12个析因点，零点实验进行了5次以估计误差。

图3 液料比对土党参多糖得率的影响Fig.3 Effect of ratio of water to material on yield of CJP

表2 Box-Behnken设计模型及实验值Table2 Box-Behnken design matrix and experimental values

2.3.2 土党参多糖提取工艺回归模型的建立及方差分析 利用Design-Expert软件对表2中的实验数据进行回归分析，得到土党参多糖得率对以上3个因素的回归方程为：

土党参多糖得率=28.15+1.30X1+3.59X2-3.58X3-1.62X1X2+4.31X1X3-1.53X2X3-4.29X12-5.55X22-4.03X32

对回归模型进行方差分析，结果见表3。

由表3可以看出：模型F值为114.72，p＜0.0001，表明模型是高度显著的；模型的失拟项p=0.3158＞0.05，表明失拟不显著，即该模型是稳定的［9］，能较好地预测实际土党参多糖提取情况。模型一次项X1、X2及X3均极显著，且显著顺序是X2（提取时间）＞X3（液料比）＞X1（提取温度）；二次项、交互项均显著，表明各具体实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

2.3.3 响应面分析及优化 对表2中的数据进行二次多元回归拟合，提取温度、提取时间、液料比3个因素之间交互作用对多糖得率的影响如图4所示。结合方差分析结果可知，3个因素之间的交互作用对土党参多糖得率的影响均显著。

利用Design-Expert软件，可得出土党参多糖最佳提取工艺条件为提取温度67.2℃、提取时间51.9 min和液料比16.6∶1 mL/g。考虑到具体操作的便利性，土党参多糖最佳提取工艺条件最终确定为提取温度67℃、提取时间52 min和液料比17∶1 mL/g。为了验证模型方程的适用性，进行了5次验证性实验，此条件下土党参多糖的平均得率为29.66%，而回归方程所得的理论预测值为29.97%，经IBM SPSS Statistics 22软件进行单样本T检验表明p=0.47，即实验值与预测值间不具有明显差异。

表3 回归模型方差分析Table3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

图4 各因素交互作用对土党参多糖得率影响的响应面图Fig.4 Response surface plot showing the effect of factors on the yield of CJP

2.4 土党参多糖的分离纯化

2.4.1 土党参多糖的DEAE-纤维素-52色谱法初步分离 将土党参粗多糖CJP溶于适量蒸馏水中，加样进行DEAE-52纤维素柱层析，依次用蒸馏水、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCI溶液梯度洗脱，自动收集器分部收集，10 mL收集1管，苯酚-硫酸法跟踪检测各管糖含量，绘制洗脱曲线，如图5所示。

图5 土党参粗多糖的DEAE-52纤维素色谱柱洗脱曲线Fig.5 Elution profile of crude CJP on DEAE Cellulose-52 column

从图5可以看出，DEAE-52纤维素柱层析用去离子水洗脱得土党参中性多糖F-1组分，用0.1 mol/L NaCl洗脱得酸性多糖组分F-2。

2.4.2 初步纯化组分经Sephadex G-100的进一步纯化 对经DEAE-52纤维素色谱柱初步纯化的组分F-1 和F-2，通过葡聚糖凝胶Sephadex G-100柱层析对其分别进行进一步纯化，得到土党参纯化多糖CJPH和CJPN。

2.5 土党参多糖的基本理化性质

土党参多糖CJP及纯化组分的CJPH和CJPN的总糖、蛋白质、糖醛酸及硫酸基含量如表4所示。

表4 土党参多糖的基本理化性质Table4 Preliminary characterization of CJP

2.6 多糖CJPH和CJPN纯度鉴定及相对分子质量测定

由图6可以看出，土党参多糖组分在色谱柱上均显示为峰形对称的单峰，说明纯化多糖组分为均一多糖。利用在一定范围内，多糖排阻体积与其相对分子质量的对数呈线性关系，通过标准曲线可知CJPH重均分子量Mw为3923 u，CJPN重均分子量Mw 为7215 u。

图6 相对分子质量测定标准曲线、CJPH及CJPN的HPLC图谱Fig.6 Standard curve of the molecular weight，HPLC spectrum of CJPH and CJPN

2.7 多糖CJPH和CJPN的单糖组成

6 种标准单糖及土党参多糖糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱图如图7所示。

图7 标准单糖、CJPH及CJPN的气相色谱图Fig.7 GC spectrum of monosaccharide references，CJPH and CJPN

对照保留时间及峰面积可知，CJPH含有半乳糖、甘露糖、葡萄糖，它们的摩尔比为1∶3.1∶6.4；CJPN含有木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，它们的摩尔比为1∶1.6∶3.7∶1.7∶6.4∶14.0。

2.8 多糖的红外光谱分析

采用KBr压片法，对土党参多糖CJPH及CJPN进行了红外光谱分析，其结果分别如图8及图9所示。

图8 土党参多糖CJPH的傅立叶变换红外光谱图Fig.8 FT-IR spectra of polysaccharides of CJPH

图9 土党参多糖CJPN的傅立叶变换红外光谱图Fig.9 FT-IR spectra of polysaccharides of CJPN

从图8可以看出，在3386 cm-1位置处出现了宽而强的多糖羟基O-H伸缩振动峰，其值小于3400 cm-1，说明为分子间氢键，2929 cm-1附近出现多糖的C-H强伸缩振动峰，这两个吸收峰均为多糖类物质的特征峰。图9也表明，在3395 cm-1和2927 cm-1位置处均出现了多糖物质的特征吸收峰。

2.9 土党参多糖对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的分化作用

通过大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12培养体系，以NGF（50 ng/mL）为阳性对照，分别加入土党参多糖（20 μg/mL）后连续培养14 d后在相差显微镜下观察细胞形态（200×），并进行显微照相，实验结果如图10所示。

从图10可以看出，土党参多糖CJPH及CJPN部分长出神经样纤维，说明CJPH及CJPN对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞具有一定的促分化作用，即CJPH及CJPN具有神经营养活性。

3 结论

图10 土党参多糖对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞分化的影响Fig.1 0 Effect of CJPH and CJPN on differentiation of rat adrenal pheochromocytoma PC12 cells

采用热水浸提法对土党参多糖的提取工艺进行了研究，考察了提取温度、提取时间及液料比三因素及其交互作用对土党参多糖得率的影响，根据Box-Benhnken中心组合实验设计，利用Design-Expert软件对数据进行回归分析，结合等高线及响应曲面图，确定了土党参多糖最佳提取工艺条件为提取温度67℃、提取时间52 min和液料比17∶1 mL/g。在此工艺下，提取得到的土党参多糖CJP经DEAE-52纤维素柱层析分离，葡聚糖凝胶Sephadex G-100柱层析纯化，得到两种土党参多糖CJPH和CJPN，并采用化学、气相色谱、高效液相色谱及红外光谱等方法对其理化性质、单糖组成等进行了分析研究。通过土党参多糖对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的分化作用研究表明，CJPH 及CJPN对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞具有一定的促分化作用，表明其具有神经营养活性。目前有关多糖神经营养活性方面的报道并不多见，通过多糖对PC12细胞的分化作用的研究，对于揭示神经营养因子类物质的作用机理以及开发利用土党参资源具有重要意义。

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Optimization of extraction conditions of polysaccharides from Campanumoea javanica Blume by response surface methodology and evaluation of its neurotrophic activities

ZHANG Zhan-jun1，2，YANG Xiao-sheng1，*
（1.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China；2.College of Biological and Chemical Engineering，Yangzhou Vocational University，Yangzhou 225009，China）

Extraction optimization，purification and physicochemicalproperties ofpolysaccharides from Campanumoea javanica Blume（CJP）were investigated.The neurotrophic activity of polysaccharides from C.javanica Blume were investigated by PC12 cell assay.Single factor experiment and response surface methodology（RSM）were used to optimize the extraction conditions of CJP.As a result，the optimal conditions were as follows：extraction temperature，67℃，extraction time，52 min，and ratio of water to raw material，17∶1 mL/g.The crude CJP were purified by DEAE-Cellulose 52 chromatography and Sephadex G-100 chromatography to afford CJPH and CJPN.The content of total sugar，protein，uronic acid and sulfate were analyzed by chemical analysis methods.HPLC analysis showed that CJPH and CJPN were homogeneous polysaccharide，the molecular weights of CJPH and CJPN were 3923 u and 7215 u，respectively.Monosaccharide composition analysis was acted by using the GC method.Infrared spectroscopy analysis indicated that CJPH and CJPN showed typical peaks of polysaccharide.The assay of PC12 cell showed that CJPH and CJPN had neurotrophic activity.Studies had shown that CJPH and CJPN could obviously repairing nerve cell damage，they had certain development value.

polysaccharides；response surface methodology；optimization；extraction；purification；characterization； bioactivity

TS201.2

B

1002-0306（2016）06-0291-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.051

2015－10－08

张占军（1977-），男，博士，副教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：moutailafite@163.com。

杨小生（1966-），男，博士，研究员，研究方向：活性天然产物研究与开发，E-mail：gzcnp@sina.cn。

贵州省科技厅人才项【黔科合人才团（2013）4006；黔科合人才［2015］4027号】；江苏省高等职业院校国内高级访问学者计划资助项目（2015FX092）。