阴沟肠杆菌耐药表型与脉冲场凝胶电泳克隆分型相关性分析

纵帅　马萍　牛国平　徐银海　丁宸　徐萍萍

阴沟肠杆菌耐药表型与脉冲场凝胶电泳克隆分型相关性分析

纵帅1马萍1牛国平2徐银海1丁宸2徐萍萍2

目的：研究ICU分离的7株阴沟肠杆菌菌株的耐药表型与脉冲场凝胶电泳（PFGE）克隆分型之间的相关性，明确临床感染和流行状况并为合理选用抗生素提供参考依据。方法：采用K-B法进行临床常用抗生素敏感性试验（AST），采用PFGE对7株阴沟肠杆菌进行克隆分型。结果：菌株呈严重的多重耐药特性；7株阴沟肠杆菌经PFGE后分为四种不同来源的克隆型；相同来源和不同来源的阴沟肠杆菌克隆株间的耐药谱均不完全相同。结论：AST 和PFGE分别在明晰阴沟肠杆菌治疗药物敏感性，临床感染和流行状况方面提供直观依据，但耐药表型和PFGE克隆型之间未发现明显的相关性；应根据药敏结果合理选用抗生素以减少或延缓强耐药菌株的播散。

阴沟肠杆菌耐药性脉冲场凝胶电泳克隆分型

阴沟肠杆菌是一种常见的条件致病菌，随着抗生素的大量和不规范使用，近年已发展成为重要的医院感染菌，常引起呼吸道、泌尿生殖道、皮肤软组织以及血流等各种感染，由于其日趋严重的多重耐药特性，使临床抗生素治疗面临严峻挑战。本文拟对ICU分离的7株阴沟肠杆菌进行耐药表型检测和脉冲场凝胶电泳（PFGE）克隆分型，分析二者之间是否存在明显的相关性，明确耐药性特点、临床感染和流行状况，为阴沟肠杆菌的抗生素治疗和流行病学研究提供参考，现报告如下：

1　资料与方法

1.1标本来源根据感染管理监控提示ICU存在阴沟肠杆菌感染，及时采集ICU 8位不同患者和不同部位（位置）的48份标本进行培养和分离，包括静脉血、脂乳、导管尖端、床头柜、呼吸机及周围环境物品等。

1.2阴沟肠杆菌的培养、分离和鉴定按照《全国临床检验操作规程》（第3版）严格进行操作。实验所用M-H琼脂为英国Oxoid公司产品，VITEK-2Compact全自动细菌鉴定仪为法国生物梅里埃公司产品。

1.3抗生素敏感性试验（AST）药敏试验采用美国临床实验室标准化委员会（CLSI）推荐的纸片扩散法，按CLSI2014标准对分离纯化后的菌株进行18种临床常用抗生素的耐药性检测。本实验采用的抗生素见表2，抗菌药物纸片为英国Oxoid公司产品。

1.4脉冲场凝胶电泳（PFGE）制备OD值在0.55～0.7之间的阴沟肠杆菌菌悬液，经CSB裂解后制备胶块，限制性内切酶Xba I 37℃水浴酶切18h，使用1.0%的Seakem Gold胶进行脉冲场凝胶电泳克隆分型，在2.2L中0.5x TBE缓冲液平衡15min后开始电泳。电泳时间：18h，脉冲切换时间：2.2s～54.2s，电压：6V/cm，T=14℃。电泳完成后胶块在0.5μg.ml-1的溴化乙锭（EB）染液中染色30min，凝胶成像仪成像。脉冲场凝胶电泳仪和凝胶成像仪均为美国Bio-RAD产品。

1.5数据分析采用WHONET 5.6软件进行耐药数据的处理和分析，Quantity One 4.6软件进行遗传关系树形图的输出和分析。

2　结果

2.1阴沟肠杆菌的分离来源及耐药性结果经培养和分离，从其中4位患者及周围环境中鉴定出7株阴沟肠杆菌，其余4位患者未检出阴沟肠杆菌，分离情况见表1。7株阴沟肠杆菌对抗菌药物的耐药性结果见表2。

表1　7株阴沟肠杆菌的分离来源

表2　7株阴沟肠杆菌对抗菌药物的耐药性

2.2PFGE克隆分型结果7株阴沟肠杆菌脉冲场凝胶电泳图见图1，其遗传关系树形图见图2。

图1

图2

3　讨论

阴沟肠杆菌是能够引起严重医院感染的重要革兰阴性致病菌，呈多重耐药特性。美国疾病控制与预防中心（CDC）在2010年首次确认了本土含有I型新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1）的阴沟肠杆菌［1］，由于含有NDM-1的细菌产生能一种特殊的β-内酰胺酶，后者水解包括碳青霉烯类在内的几乎所有的β-内酰胺类抗生素，被称为“超级细菌”，因此，阴沟肠杆菌院内感染的监控和研究越来越受到重视。

3.1临床感染和耐药性分析本实验采集了ICU八位患者不同部位的48份标本，每位患者均采集静脉血、脂乳、导管尖端、床头柜、被褥和床单等六个位置进行培养，共培养出7株阴沟肠杆菌，患者甲、乙、丙和丁四人分离出病原菌，其余四位患者检出其它病原菌或未检出病原菌。其中患者丙的静脉血、脂乳和导管尖端分别分离出三株阴沟肠杆菌，说明该ICU病区患者感染情况严重（见表1）。AST结果显示7株阴沟肠杆菌对常用抗生素存在不同程度的多重耐药，与国内相关报道相似［2］。其中，对头孢唑啉、头孢西丁和头孢替坦全部耐药，对厄他培南、亚胺培南和替加环素全部敏感。结合菌株分离情况和PFGE分型结果，患者丙不仅感染交叉现象，也存在严重耐药情况，应根据药敏结果进行积极的抗生素感染治疗。

3.2PFGE克隆分型结果解读分子分型有多种方法，PFGE仍是目前较为公认的分子分型的“金标准”，是分子流行病学中溯源研究的重要手段［3］。为明确患者的感染状况及与耐药性之间的关系，对分离的7株阴沟肠杆菌行PFGE分子分型。为方便观察，我们根据初次PFGE结果进行了二次实验（图1），并利用QuantityOne软件输出了7株菌株之间的遗传关系树形图（图2）。参照Tenover FC等［4］提出的PFGE条带解释标准和目前研究成果，通常将相似度80%以上的菌株认为是来源于同一克隆株，而相似度低于50%的菌株则被认为克隆来源不同，其流行病学不相关；或者根据有1～3条条带不同可认为是同一克隆，4～6条不同为可能相关，7条及以上不同为不相关的分型标准。实验根据上述两条标准分型结果相同，显示7株阴沟肠杆菌被分为四种不同来源的克隆型，其中1、2、3和4号菌株被认为来源于同一克隆，5、6和7号菌株克隆来源各不相同，表明该ICU阴沟肠杆菌已爆发流行，且存在严重的感染交叉情况，应采取相应措施控制菌株的播散。

3.3PFGE克隆分型与耐药表型相关性分析根据PFGE分型结果对比各克隆型菌株间的耐药谱，结果显示相同克隆来源株中1号和4号菌株耐药谱完全相同，2号、3号与前两株的耐药谱不完全相同；不同克隆来源株中5、6、7号菌株的耐药谱不同；2号和7号两个不同克隆来源菌株间的耐药谱则完全相同，提示菌株的克隆来源和耐药性之间未发现明显的相关性，PFGE分型结果不能用于菌株耐药表型的预测，耐药表型也不能用于克隆株的流行病学预测。其它菌株的研究也得出了相似结论［5～6］。其产生机制目前国内相关研究较少，作者推测可能与克隆株在增殖播散的过程中耐药基因的获取、丢失或水平传播等基因突变有关，也与PFGE分型主要针对细菌或质粒的整个基因组，并不能完全反映耐药株的耐药基因和其它基因特征有关［6］。我们将依据此次结果，进一步扩大菌株数量，利用PCR检测相同克隆株和不同克隆株的耐药基因并分析它们之间的差异，以探明本文所述现象的产生机制。

1Centers for Disease Control and Prevention（CDC）. DetectionofEnterobacteriaceaeisolatescarrying metallo-beta-lactamase-UnitedStates，2010［J］. MMWR.Morb.Mortal.Wkly.Rep，2010，59（24）：750.

2陈峰，李维春，张克昌.新生儿重症监护病房血培养122株病原菌分布及耐药性分析［J］.安徽卫生职业技术学院学报，2012，11（2）：72～73.

3Zheng J，Keys CE，Zhao S，et al.Simultaneous analysis of multiple enzymes increases accuracy of pulsed-field gel electrophoresis in assigning genetic relationships among homogeneous Salmonella strains ［J］.Journal of clinical microbiology，2011，49（1）：85～94.

4Tenover FC，Arbeit RD，Goering RV，et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis：criteria for bacterial strain typing［J］.Journal of clinical microbiology，1995，33（9）：2233～2239.

5王迪，张晓嫒，陈倩，等.北京市食源性金黄色葡萄球菌耐药及分子分型研究［J］.中国食品卫生杂志，2014，26（5）：428～434.

6金辉，徐小敏，糜祖煌，等.鲍曼不动杆菌的耐药基因分型与脉冲场凝胶电泳分型的比较［J］.环境与职业医学，2010，27（4）：219～221.

/（编审：徐元宏）

Analysis of the correlation between antibiotic resistance and pulsed-field gel electrophoresis clonal typing of Enterobacter cloacae

1.Affiliated Hospital，Xuzhou Medical University，Xuzhou 221003，Jiangsu
2.Xuzhou Central Hospital，Xuzhou，221003，Jiangsu
ZONG Shuai1，MA Ping1，NIU Guo-ping2，et al

Objective:OBJECTIVE To student on the relationship between antibiotic resistance and pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）clonal typing of seven strains of Enterobacter cloacae isolated from ICU，make clear the clinical infection and prevalence status，and provide a scientific reference for selection of antibiotics.Methods:The antibiotics susceptibility tests（AST）were performed by the disk diffusion test，and the molecular typing of seven strains was tested by PFGE.Results:AST showed character of multiple antibiotic resistance，seven strains of Enterobacter cloacae were classified into four kinds of different clones，and the drug resistant spectrum was not identical between same clonal isolates and different clonal isolates.Conclusion:AST and PFGE clonal typing could provide evidence directly in drug resistant spectrum and nosocomial infection and prevalence status，but there was no obvious correlation between drug resistant and clonotypes.Antibiotics should be selected reasonably based on AST so as to reduce or delay strong resistant strains to spread out.

Enterobacter cloacae；Drug resistance；PFGE；Clonal typing

R331【文献标识码】A

1671－8054（2016）01-0099-03

1.徐州市徐州医学院附属医院检验科江苏221002 2.徐州市中心医院检验科江苏221002

徐萍萍，女，检验师

2015-12-05收稿，2016-01-19修回