重离子12C6+辐照对人肺癌细胞增殖的影响

徐华　杜文静　车团结

重离子12C6+辐照对人肺癌细胞增殖的影响

徐华杜文静车团结

目的：探讨12C6+射线辐照人肺癌细胞株H1299细胞的生物学效应。方法：以不同剂量的12C6+辐照H1299细胞，并培养24，48，72小时收获细胞。采用MTT法检测H1299细胞增殖情况。结果：12C6+辐照H1299细胞后，细胞呈现明显的形态学改变。MTT法检测发现，在一定剂量范围内，随着辐照剂量的增加，H1299细胞的OD值逐渐减少，与假照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：12C6+辐射在2Gy范围内辐照H1299细胞，具有明显抑制其增殖的作用。

12C6+；细胞增殖；H1299细胞

原发性肺癌是我国高死亡率的恶性肿瘤之一，且有逐年升高趋势。放疗已成其治疗的主要手段［1］。研究表明，传统的常规放射治疗，射线随着射程的增加，剂量呈指数衰减，临床毒副作用多［2］。而重离子照射能使辐射剂量积聚在肿瘤部位的Bragg峰，有效的杀伤肿瘤细胞，减少对周围正常组织的损伤［3］，是新型放疗的发展方向。日本研究人员分析了重离子治疗111例早期非小肺癌，局部控制率80%-90%，3年生存率73%-76%。结果优于常规的放疗［4］。然而重离子在临床应用上仍属探索阶段，研究表明，放疗的抗肿瘤机制是通过不同的信号传导通路，抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡［5］。为了进一步确定重离子辐照在促肺癌细胞凋亡作用中的机理及安全剂量，本研究以12C6+辐照对H1299细胞增殖的影响为例，针对其辐照时间及辐照剂量对肺癌细胞H1299的不同抑制作用进行探讨，为重离子放射治疗肺癌提供实验依据。

1　材料和方法

1.1细胞培养 H1299细胞来源中国科学院兰州近代物

理研究所实验室。常规方法复苏、传代、培养。取指数生长期H1299细胞，将其接种于含10%胎牛血清RPMI-1640培养基中，内含青霉素100u/ml和链霉素100u/ml。置5%CO2培养箱37℃培养至细胞完全贴壁。每2-3天传代1次。12C6+辐照前一天将指数生长期的H1299细胞按5×106个/ml接种到φ35mm的玻璃培养皿中。每次实验均使用同一批次冻存的细胞。细胞于中国科学院兰州近代物理研究所重离子研究装置的辐照终端进行12C6辐照。平均辐照剂量率为2 Gy/min将各组H1299细胞放置于12C6+离子束的Bragg峰区进行照射。采用1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0Gy剂量照射后，培养24h，48h，72h收集细胞。70%的冰乙醇固定，4℃保存备用。

1.2MTT法测定经不同剂量的12C6+辐照的H1299细胞，经胰酶消化分离后，血球计数板计数，将细胞浓度调整为5×104个/ml，接种于96孔板（Costar，Germay）中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。培养24h，48h，72h不同时段点后，将每孔加入新鲜配制的MTT（5mg/ ml）20μl，37℃细胞培养箱中继续培养4h。吸弃孔内上清液，加入150μl二甲基亚砜（DMSO），在微孔板上充分振荡混匀10min，酶联免疫检测仪（波长492nm）上测各孔的吸光度值（OD）值，各剂量组均设3个平行孔，独立重复3次实验，记录结果绘制量效曲线。细胞存活率（%）=实验组平均OD值/对照组平均OD值× 100%。

1.3统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

结果显示，当12C6+剂量为2Gy时，培养24h后，H1299细胞的OD值为0.820±0.023，与假照组0.993± 0.012比较，细胞增殖减弱（P＜0.05），培养24h，48h和72h细胞存活率分别为82.58%，71.25%和71.23%。当12C6+剂量为4Gy时，培养24h，48h和72h后，H1299细胞的OD值分别0.516±0.018，0.472±0.0120，232±0.026，与假照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。其细胞存活率分别为51.86%，41.79%和22.79%，与假照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。随着12C6+辐照剂量的增加，H1299细胞增殖活性逐渐下降，相同剂量的12C6+辐照随着培养时间延迟其细胞增殖活性逐渐下降。H1299细胞生长曲线变化表明，其生长抑制作用呈时间和剂量依赖性。5.0Gy以上的照射剂量，则出现较多坏死细胞。实验表明12C6+辐射在2-4Gy范围内辐照H1299细胞，具有较好的抑制细胞增殖的作用。见表1。

表1　不同照射时间、照射剂量对H1299细胞增殖影响（±s,n=3）

表1　不同照射时间、照射剂量对H1299细胞增殖影响（±s,n=3）

注：*与假照组比较P＜0.05，**假照组比较P＜0.01

照射剂量（Gy）0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 72 h 1.008±0.022 0.933±0.025 0.731±0.036** 0.388±0.027** 0.232±0.026** 0.232±0.026** 0.182±0.016** 24 h 0.993±0.012 0.982±0.011 0.820±0.023* 0.620±0.031** 0.516±0.018** 0.515±0.018** 0.415±0.012** 48 h 1.126±0.020 0.986±0.012 0.803±0.023** 0.526±0.025** 0.472±0.012** 0.471±0.022** 0.301±0.021**

图1　不同剂量12C6辐照H1299后细胞存活率变化

3　讨论

随着核科学技术的进步和发展，重离子在物理学和生物学上表现出的不同特性受到关注。重离子束不同于常规射线特有的倒转深度剂量分布以及相对高的生物学效应等，使得重离子不仅可以彻底杀灭肿瘤细胞，而且对常规放射抗拒的肿瘤也能取得良好的疗效［6］。Yamamoto等人分析1994-1999年日本采用12C6+治疗肺癌病人的分析报道，采用剂量递增法确定最佳剂量，取得较好临床效果［7］。但如何选定重离子体外辐照人非小细胞肺癌的辐射剂量尚无实验报道。MTT比色实验是一种检测细胞存活和生长的方法之一。本研究中，采用MTT法观察不同时间和剂量12C6+辐照H1299细胞生长抑制变化，采用剂量递增法确定适宜剂量，结果表明当12C6+剂量为2Gy时，H1299细胞生长增殖受到抑制，细胞存活率下降，当12C6+剂量为4Gy时，细胞增殖率下降明显，且呈剂量-时间依赖性，5.0Gy以上的照射，出现较多的坏死细胞。辐照剂量越大在体外的杀伤肿瘤细胞的效果越好，但过高的辐照剂量也会导致严重的辐射损伤。实验表明12C6+辐射在2-4Gy范围内辐照H1299细胞，具有较好的抑制细胞增殖的作用。本实验结果与前期研究的重离子辐照人肝癌细胞SMMC7721细胞的增殖抑制作用类似［8］。但未进行同一实验的比较，尚不能确定对哪一类肿瘤细胞杀伤力更强。

人类作为一个复杂的生物体，具有更强的代谢和防御机制。目前只有日本、中国、德国、美国在研究高能重离子束治疗肿瘤，现处于临床试验阶段，治疗肿瘤远期效果有待于进一步跟踪观察。本研究将在上述研究的基础上，进一步探讨如下问题：探讨重离子辐照肺癌H1299细胞凋亡和细胞周期的调控作用，研究H1299细胞凋亡的线粒体通路调节机制与相关蛋白的关系。体外细胞实验仅能对重离子促进细胞凋亡提供一定的实验数据，为临床治疗提供一定的参考，而探讨重离子放射治疗人体内肿瘤的安全剂量尚需进一步深入研究。

［1］段纪俊，陈万青，张思维.中国恶性肿瘤死亡率的国际比较［J］.中国社会医学杂志2009，6（6）:377-378.

［2］张宽智，林建民，杨英军，等.辨证治疗癌症化、放疗毒副反应［J］.中国肿瘤临床与康复，2001，5（5）:78-79.

［3］Kanai T，Furusawa Y，Fukutsu K，et al.Irradiation of mixed beam and design of spread-out Bragg peak for heavy-ion radiotherapy［J］.Radiat Res，1997，147（3）:78-85.

［4］Fujii O，Demizu Y，Hashimoto N，et al.A retrospective comparison of proton therapy and carbon ion therapy for stage I non-small cell lung cancer［J］.Radiother Oncol，2013，109（1）:32-37

［5］Demizu Y，Kagawa K，Ejima Y，et al.Cell biological basis for combina-tion radiotherapy using heavy-ion beams and high-energy X-rays［J］. Radiother Oncol，2004，71（2）:207-211.

［6］Blakely EA，Kronenberg A.Heavy-ion radiobiology:new approaches to delineate mechanisms underlying enhanced biological effectiveness［J］. Radiat Res，1998，150（5）:126-145.

［7］Yamamoto N，Baba M，Kamade T，et al.Particle therapy-carbon ion radiotherapy for non-small cell lung cancer［J］.Nihon Rinsho 2010，68（6）: 1040-1044.

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Effect of12C6+irradiation on human lung cancer cell line H1299 proliferation in vitro

Xu Hua1，Du Wenjing2，CheTuanjie3.

1.Department of Internal Medicine，Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；2.Institute of Biology，Gansu Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China；3.School of Life Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

Objective：To investigate the biological effect of12C6+irradiation in human lung cancer cell line H1299.Methods：Irradiate cell H1299 by12C6+with different dose，after that，continue to foster，and get in the cells at 24，48，72 h.The test of cell proliferation was observed by microculture tetrazolium test（MTT）.Results：After irradiated cell H1299 by12C6+，it showed typical morphological changes.The proliferation rate tended to decrease with the radiation dose increasing.which showed dose-dependent manner.The MTT results showed that OD was significantly decreased，compared with the control group（P＜0.01）.Conclusion：Irradiation of12C6+on cell H1299 could obviously restrain proliferation of cell H1299 within the dose of 2Gy.

12C6+；cell proliferation；H1299

A

1004-2725（2016）01-0007-03

730000甘肃兰州，兰州大学校医院内科（徐华）；730000甘肃兰州，甘肃省科学院生物所（杜文静）；730000甘肃兰州，兰州大学生命科学学院（车团结）

徐华，E-mail：765837231@qq.com