荧光法测叶绿素在压载水检测中的应用及前景

李建谊， 张　波， 汪　璇

(1.上海欧陆科仪有限公司， 上海 201216； 2.河北海事局， 河北 秦皇岛 066000； 3.上海船舶工艺研究所， 上海200032)



荧光法测叶绿素在压载水检测中的应用及前景

李建谊1， 张波2， 汪璇3

(1.上海欧陆科仪有限公司， 上海 201216； 2.河北海事局， 河北 秦皇岛 066000； 3.上海船舶工艺研究所， 上海200032)

荧光法是一种被行业公认的检测压载水中叶绿素含量最有效的方法，已被广泛应用于压载水检测领域，此方法也显示出了极大的发展前景和应用价值。提出了一种新型的叶绿素检测仪器，经过一系列的试验，验证了此仪器的实用性、精确性和有效性。并分析了此技术的前景，为未来的发展提出了方向和展望。

荧光法叶绿素压载水检测

0　引言

由船舶压载水携带的海洋物种对海洋环境的侵害被认为是海洋的四大危害之一。据估计，每年约有100亿吨的压载水在全球转移，每天约有超过3 000种生物通过压载水在全世界范围内迁徙[1]。为此，国际海事组织(IMO)于2004年2月13日在伦敦通过了《国际船舶压载水和沉积物管理与控制公约》，以更好地管理和控制压载水的取排。该公约共有22条条款和一条规则附则，附则的D-2为压载水性能标准，该标准对未来船舶排放压载水中的活体生物数量做了明确规定[2]，如表1所示。

大洋水中主要的小型活体是微藻，而叶绿素α广泛存在于所有的藻类中，通过对浮游植物叶绿素的测量可以得知有生产力的活体细胞丰度。浮游植物叶绿素α浓度的测定有多种方法，其中常用的有分光光度法、荧光光度法和高效液相色谱法(HPLC)[3]。高效液相色谱法能够精确地测定各种光合色素的含量，但由于仪器昂贵，分析操作步骤繁琐，一般不能用于野外大量样品的快速分析[4]。分光光度法最为常用，其测定仪器简单，一般实验室都有配备，且已具备完善的测定体系。这种方法得到的数据相对准确，但测试程序耗时，需要有经验的分析人员操作，以确保良好的数据及长期的一致性，遗憾的是不能用于大量样本的快速、实时监测[5]。荧光光度法作为微量分析的经典方法，能精确地测定叶绿素α的含量，其灵敏度是分光光度法的50倍以上, 且不需要萃取。 特别是脉冲幅度调制(PAM)荧光技术的出现，为叶绿素荧光的野外现场、原位测量提供了技术支持。PAM荧光技术还能测量植物在光合作用中叶绿素对光能的利用效率，进而可判断植物细胞的活性，为分析压载水中的微藻奠定了良好的基础。PAM 脉冲幅度调制荧光技术信号原理如图1所示。

表1　IMO D-2排放标准

图1　PAM 脉冲幅度调制荧光技术信号原理

1　仪器开发

普通的叶绿素荧光测量多是在萃取液中进行(见图2)。叶绿素α荧光在不同介质中激发与诱导出的波长会有所不同，其中红色激发波长与诱导出的波长很接近。因此，如何有效地检测水体中微藻的叶绿素α荧光微弱的信号，并且仪器体积小、方便现场使用，都是仪器开发者必须考虑的问题。

图2　样品池中饱和光通过样品后激发出近红荧光

仪器开发首先寻找、试验叶绿素α在水体中的激发和发射波长，然后进一步优化有关光学器件，控制好激发与接受荧光的光谱带宽以及截止深度，使到达接受器的是干净的荧光，即不含有其它波长的干扰光。其次，筛选合适的接受器。接受器不仅要求灵敏度高，还要求响应时间短，以满足PAM技术的需要。随后采用可靠的前置光电转化电路、滤波和锁相放大技术将微弱的荧光有效地提取并转化为电信号，经放大并滤去噪声，成为平稳的直流信号。然后通过数模转换器件转化为数字信号送入单片机，再辅以软件的数字滤波技术对数字信号进一步滤波降噪，得到稳定的信号值。最后通过测量已知浓度叶绿素α的荧光值建立起叶绿素α浓度与荧光值之间的关系，再配制不同浓度的叶绿素α溶液验证仪器的准确度及线性。在仪器能够准确测量叶绿素α浓度的前提下，直接测量水体中微藻，以尝试利用叶绿素荧光法测量压载水中的微藻。

2　仪器试验

目前开发的便携式快速检测设施一般在船上、海上以及户外使用，保证在测量范围内其可靠性及重复性达到应用的要求。ET 1301是一台防水(洒水) 、不用预热、使用5号电池运作、受环境光线影响小、操作简便的仪器。该仪器有多个模式, 包括可同时手动输入水样品的其他参数, 以便在之后的数据处理中有更完整的参数。针对活体藻细胞, 使用1 mm×1 mm的荧光比色皿, 但不要求严格的配对使用, 令测量的操作出错机会更低。图3为ET 1301便携式叶绿素荧光仪。整个仪器可以放在手掌上操作。仪器表面有一个放置标准荧光比色皿的样品室、操作键盘和显示屏。操作时，可以在键盘上输入并显示日期等信息。测量叶绿素α的荧光值时，会显示出叶绿素α的浓度和生产量，以及原始的荧光值Fo、Fm。另有校准功能供用户定期检查和标定仪器。

图3　ET 1301便携式叶绿素荧光仪

2.1叶绿素α标准品的检测

将购得的叶绿素α标准品在弱光下小心地称取1 mg，溶于100 mL 100%甲醇中，充分混匀后，得标准溶液浓度为10 mg/L，用铝箔纸包覆以避光。

将标准溶液稀释100倍，分别检测在665.2 nm和652.0 nm的吸光度A665.2、A652.0，经公式Chl α= 16.29A665.2-8.54A652.0计算结果[6]，标定叶绿素α溶液浓度为98.22 μg/L。

将此溶液分别稀释2、5、10、20、40、100、200、400、1 000倍，用ET 1301荧光仪检测，结果如表2所示。

表2　叶绿素α标准品检测结果

注：表中实测值为三次检测后的平均值。

由表2可以看出，荧光法检测叶绿素α浓度的准确度和灵敏度都很好。由于是标准品，本身并没有叶绿素生产量，所以其实测数据都接近0。

2.2活藻的检测

实验样品使用采购的单纯原甲藻液，如图4所示。图中左侧是活的甲藻，叶绿体仍有丰富的叶绿素；右侧的是死亡的甲藻，体内的物质已基本分解。吸取0.5 mL注入计数板，在500倍的显微镜下观察并计数。计数时不分是否存活，但不计算死亡后由于分解不含叶绿素的细胞。同时将原液按一定的比例稀释，用已校准过的叶绿素荧光仪检测其叶绿素的浓度和生产量，以观察单一藻种的叶绿素浓度与个体之间的关系。所有操作过程中不使用固定剂。

图4　测试水样中的甲藻

由于微藻含量稀少，需多次取液观察计数，取每次计数的平均值作为原液的原甲藻含量，约为5 560个/mL。以两组不同的稀释比例试验，结果如表3所示。

表3　不同含量的原甲藻液与叶绿素浓度及其荧光值

表中原甲藻的含量由原液的含量按稀释的比例计算而得，荧光值F0、Fm为仪器测量所得数据，叶绿素浓度和叶绿素生产量则是仪器由荧光值计算所得，其中仪器已自动扣除本身的本底值。

由表3的数据可知，叶绿素荧光值F0或叶绿素浓度与原甲藻的含量成较好的线性关系，其线性相关系数R2=0.9983，而叶绿素的生产量与原甲藻的含量基本没有线性关系。

因此，对单一藻种而言，通过标定后的仪器直接检测微藻的个数是可行的，且灵敏度高，能达到检测近百个中型原甲藻数量。然而，表3的数据也说明，即使是单一的藻种，用叶绿素荧光技术直接检测压载水中低至10个/mL的微藻活体数量，还存在很大差距。

叶绿素生产量是叶绿素对光能量利用效率的表征，可间接表达微藻的活性，或微藻的活体量。叶绿素生产量与原甲藻含量没有线性关系正说明了微藻活体量与微藻整体含量没有关联。

3　应用前景

应用叶绿素荧光技术可直接测量水体中微藻的含量, 无需萃取等样品前处理过程。由于实际水体中含有各类藻种，且温度、盐度、光照等都会影响微藻生理状况与叶绿素荧光及生产量，而叶绿素荧光法测量的是叶绿素浓度和生产量，不能给出各种微藻活体的数量，只能是一种半定量的方法。因此，单独使用叶绿素荧光技术检测水体中的微藻含量，具

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有一定的局限性，特别是微藻活体含量稀少至10个/mL以下的合格压载水。然而，叶绿素荧光法作为高灵敏度、快速、简便、无污染的检测方法，若辅以采样时的富集浓缩手段，对压载水微藻含量的现场快速检测仍具有参考价值，而浓缩所需要的水体量也显著低于传统分析方法所需要的水体量。ET1301便携式叶绿素荧光仪设计体积小、操作简单，使用电池供电、保证本质安全，没有萃取、染色等前处理过程，可有效避免繁琐的前处理过程可能产生的偏差，使用人员无需特别培训即可操作，可携带上船直接测量，缩减了压载水传统分析方法的取样时间和工作量及费用，对加快船舶的进出港运营和港口国检查(PSC)的实施也有帮助。

D-2标准中关于浮游植物的指标检测存在两个问题：一方面，这两个指标限值很低，必须采集大量的水样，并对水样进行浓缩，才能达到大多计数方法的检测底限。另一方面，指标要求将压载水中不同种类活体数量的总和计数出来，这意味着采用的计数方法不但需能区别不同种类的生物，且能区分不同种类生物的死活。此外，港口每天要靠港大量船舶，船舶的靠港费用昂贵，这就要求检测耗时要尽可能短。而叶绿素荧光仪检测具有操作简单、样品量小、灵敏度高、可直接用活体检测的特点，在国际上已获得越来越多的认可。

[1]党坤，宋家慧，赵殿荣，等.船舶压载水问题综述[J]. 航海技术，2001(4)：60-63.

[2]廖铭胜. 《国际船舶压载水和沉积物管理与控制公约》简介[J].交通环保，2004，25(5)：48-50.

[3]Wetzel R G, Likens G E. Limnology：Lake and River Ecosystems, 3rd edition[M]. New York: Springer,2000.

[4]Jacobsen T R. Comparison of chlorophyll a measurements by fluorometric, spectrophotometric and high pressure liquid chromatographic methods in aquatic environment[J]. Ergebnisse Der Limnologie, 1982(16):35-45.

[5]张江龙. 叶绿素监测仪器在水质自动监测应用中的优劣浅析[J].现代科学仪器,2007(1):41-43.

[6]高坤山. 藻类固碳——理论、进展与方法[M]. 北京：科学出版社,2014.

Application and Prospect of Measuring Chlorophyll Using Fluorescence Method for Ballast Water Tests

LI Jian-yi1, ZHANG Bo2, WANG Xuan3

(1.Shanghai Euro Tech Co., Ltd., Shanghai 201216, China; 2.HEBEI Maritime Safety Administration of People’s Republic of China, Qinghuangdao Hebei 066000, China;3.Shanghai Shipbuilding Technology Research Institute, Shanghai 200032, China)

The widely used Fluorescence Method is considered as the most effective way to measure chlorophyll in ballast water test and it has tremendous development prospect and application value. A new kind of chlorophyll measurement equipment with practicability, precision and effectiveness after experimental verification was proposed. Prospect of the technology and comes up with the future development and expectation was analyzed.

Fluorescence MethodChlorophyllBallast waterTest

李建谊(1962-)，男，高级工程师，主要研究方向为仪器仪表技术。

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