响应面法提取海带中活性成分甘露醇

□ 刘　萌　王焯筠　郑州工程技术学院

响应面法提取海带中活性成分甘露醇

□ 刘萌王焯筠郑州工程技术学院

本文选用海带为材料，采用水浴法提取分离甘露醇。通过单因素实验确定影响甘露醇提取的主要因素，并在此基础上利用响应面分析法对海带中甘露醇提取工艺进行优化。通过岭脊分析寻优得出，在时间为3 h，温度为30℃，固液比（海带/水溶液）为1/50的条件下，甘露醇的得率最高为22.1 mg/g，比初始条件提高了23%。

甘露醇是一种无色、不吸湿的晶体，在食品、医药、化工等行业中，甘露醇都具有广阔的应用前景。甘露醇可采用葡萄糖或蔗糖溶液电解还原或催化还原的方法获得，也可从海带、海藻中提取。目前，我国海带养殖产业发展成熟，海带产量也跃增至世界第一位。海带功能众多，养殖成本低，在食品加工和有益物质的提取中作用明显，因此利用海带作为生产甘露醇的原料，即可使资源得到更有效的开发，也体现了海带更重要的经济价值。本文的研究工作旨在优化甘露醇提取工艺条件，提高甘露醇的提取率，获得较高的经济效益，为海带活性物质的提取提供有力依据。

材料与仪器

实验材料

干海带，市售，产于山东省长岛县，人工养殖；浓盐酸、浓硫酸、无水乙醇、乙酸铵等均为分析纯。D-甘露醇，纯度≥98%，中国药品生物制品检定所。

主要仪器

KDC-16H高速离心机、HZS-H恒温水浴锅、台式M295356低速离心机、T6新世纪紫外可见分光光度计、PHS-3C精密pH计。

实验方法

海带中甘露醇的提取

称取3.0 g剪碎的干海带，于20℃下在150 mL蒸馏水中浸泡，并用硫酸不断调节pH值，使浸泡液的pH值达到2。过滤后，以浓度为1.0 mg/mL的石灰水中和滤液，分离过滤两次，提取清液并浓缩清液至原体积的1/4。在清液中加入3倍体积的无水乙醇，得到的沉淀即为甘露醇。

甘露醇标准曲线的绘制

准确称取0.1 g D-甘露醇，加水溶解并于100 mL容量瓶中定容，配制浓度为1 mg/mL的甘露醇标准溶液。吸取甘露醇标液1、2、3、4、5、6 mL分别置于100 mL容量瓶，用蒸馏水稀释定容，配置浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的甘露醇溶液。吸取上述溶液各1 mL，置于标号为1、2、3、4、5、6的试管内，分别加入高碘酸钠溶液1 mL，混合均匀，室温放置10 min，再依次加入Nash试剂4 mL，53℃水浴保温15 min后冷却到室温，以蒸馏水作为空白对照，于413 nm波长处测定其吸光度。以吸光度为横坐标，甘露醇标准液的体积浓度为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示。

图1　甘露醇的标准曲线

海带中甘露醇提取量的测定

吸取8 mL制备得到的粗甘露醇溶液于100 mL的容量瓶内稀释定容。从上述溶液中吸取1.0 mL按照2.2中的步骤测定其吸光度。在标准曲线上读取甘露醇的体积浓度。

提取量=（体积浓度×100 mL×粗提液的体积/吸取的体积）/原料的质量

单因素实验设计

选取影响甘露醇提取得率的主要因素：温度选取20℃、30℃、40℃、50℃ 4个水平；提取时间为1 h、2 h、3 h、4 h 4个水平；固液比（海带/水溶液）选取1/40、1/50、1/60、1/70 4个水平分别进行单因素实验。

响应面法实验设计

以单因素实验的结果为基础，根据Box-BenhnKen中心组合的设计原理，设定水平编码表，见表1。

表1　响应面分析实验因素水平表

结果与分析

单因素实验设计结果与分析

通过单因素实验确定提取温度、提取时间、固液比对甘露醇提取量的影响如图2、图3、图4所示。

图2　提取温度对甘露醇提取量的影响

图3　提取时间对甘露醇提取量的影响

由图2可知，在提取时间为3 h，固液比（海带/水溶液）为1/50（g/ mL）的条件下，当提取温度小于30℃时，甘露醇提取量随温度的升高而增大；当温度大于30℃，提取量随温度的升高而下降；当温度达到30℃，提取量最高。

在提取温度为20℃，固液比（海带/水溶液）为1/50（g/mL）的条件下，提取时间对甘露醇提取量的影响如图3所示。由图3可知，甘露醇的提取量随着提取时间的增长而增大。当提取时间大于3 h，提取量变化不大。

图4　固液比对甘露醇提取量的影响

在提取时间为3 h，提取温度为20℃的条件下，固液比（海带/水溶液）对甘露醇提取量的影响如图4所示。随着固液比的增大，提取量几乎直线上升，当固液比（海带/水溶液）达到1/50时，提取量最大，随后就趋于下降。

响应面法实验结果与分析

以单因素实验结果为基础，运用Box-Benhnken中心组合实验设计方案，甘露醇提取量的测定结果如表1所示。

1数据分析

根据表1的实验结果，用SAS统计分析软件进行多元回归分析，经回归方程拟合后，实验因子对甘露醇的粗提取量的影响以回归方程表示为：Y1=21.47667+1.575*X-1+0.13*X2-0.0125*X3-3.153333*X-1*X1-0.1*X1*X2- 0.365*X1*X3 -1.918333*X2*X2+0.32*X-2*X3-0.513333*X3*X3

从表2中可以看出，用上述回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其因变量和自变量之间的线性关系显著，决定系数为96.93%，回归方程拟合程度很好。

表3中的F检验显示，总回归达到显著。表明时间、温度、固液比三个因素与对海带中甘露醇提取率总的来说存在显著的回归关系。

2寻取最优值

利用SAS软件进行岭脊分析以确定各因素的最佳取值。通过分析后，得出回归模型存在最大值点，Y的最大估计值为21.9 mg/g，各因素的取值分别为：温度30℃，时间3 h，固液比(海带/水溶液)1/50，在以上优化条件下进行验证实验，共进行3批次甘露醇提取实验，证明预测值21.9 mg/g与实验平均值22.1 mg/g非常接近。

表1　Box-Benhnken实验设计方案与实验结果

表2　回归方程偏回归系数的估计值

表3　回归方程的方差分析

结论

本文通过单因素实验和响应面实验优化海带中甘露醇的提取条件，最终确定影响提取量的因素的主次顺序为固液比（海带/水溶液）>提取温度>提取时间，最佳提取条件为：温度为30℃，时间为3 h，固液比（海带/水溶液）为1/50（g/mL）。在此最佳条件下，海带中甘露醇的提取量为22.1 mg/g，比初始条件提高了23%。

刘萌（1986-），女，河南平顶山人，硕士研究生，助教。研究方向：生物学。王焯筠（1988-），女，河南驻马店人，硕士研究生，助教。研究方向：食品。