湿地植物小叶章SSR引物筛选及反应体系优化

2016-09-15徐明怡王丽媛冷海楠张玉倪红伟黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室哈尔滨150040

国土与自然资源研究 2016年3期

徐明怡，王丽媛，冷海楠，张玉，倪红伟（黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室，哈尔滨150040）

徐明怡，王丽媛，冷海楠，张玉，倪红伟*
（黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室，哈尔滨150040）

开引物发合适的小叶章PCR-SSR引物并建立优化的反应体系是开展小叶章遗传多样性研究的基础。利用正价设计方法对小叶章SSR反应体系中的DNA模板和引物2个反应因素进行了9个水平的优化，并通过温度梯度优化引物退火温度。自主开发了51对小叶章SSR引物，筛选出12对扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物，为小叶章遗传多样性研究提供方法和理论依据。

小叶章；SSR分子标记；引物筛选

小叶章（Deyeuxia angustifolia）是禾本科野青茅属植物。主要分布于我国的东北、华北、内蒙古等地区的平原低湿地［1］。是三江平原典型草甸、沼泽化草甸的建群植物和优势植物，沼泽植被中的优势种、亚优势种或重要伴生种［2］。气候、土壤、水文及人类活动对会小叶章这样的湿地植物产生影响，同时小叶章也对这些影响表现出灵敏的反应［3，4］，可以用来指示湿地生态功能和生态环境的变化［5］。国内外对小叶章的研究多集中在生理生态学方面［6-9］。

近年来，随着生物技术的迅猛发展，分子标记成为小叶章群落的系统关系等研究的重要手段。SSR （Simplesequence repeats，简单重复序列）又称微卫星（Micro satellite DNA），与其他分子标记相比较，SSR的优点是多态性频率高、重复性好和可靠性高，可以检测更多等位基因位点［10］，在植物遗传多样性研究中被广泛应用。

虽然SSR标记在小麦［11］、水稻［12］等作的物遗传图谱构建、种质多样性分析、分子辅助育种以及品种鉴定等方面有所应用，但由于微卫星引物专一性极强，开发出的SSR引物对小叶章并不适合。因此开发出小叶章SSR引物，建立其SSR-PCR反应体系对小叶章分子生物学研究非常必要。

本研究通过正交设计及温度梯度试验探索小叶章SSR-PCR反应的最适条件，并筛选出多态性丰富的引物，旨在建立一套适合小叶章的高效、稳定的SSR反应体系，为小叶章群体遗传学和分子生态学研究提供科学依据。

1　材料与方法

1.1供试材料

引物筛选及优化体系所用小叶章取自洪河国家自然保护区内的黑龙江省科学院自然与生态研究所三江平原湿地生态定位研究站。典型草甸和沼泽化草甸两个生态类型各5个地点的10份小叶章样品（每个地点1份）。2015年6月在各地点采集新鲜无病斑嫩叶，液氮速冻后带回实验室于-80℃条件下保存备用。

1.2试验方法

1.2.1DNA的提取和检测

DNA的提取按购自北京天根生物有限公司的植物DNA提取试剂盒（离心柱型）说明书进行，略有改动。利用紫外可见分光光度计检测DNA纯度和浓度，在2％的琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃条件下保存备用。

1.2.2引物的选择

试验所选用引物根据实验室前期研究基础，基于小叶章转录组数据自主设计的引物，根据已知序列用SSR Humter软件搜索含重复5次以上核苷酸序列的元件，利用Primer Premier 5软件遵循引物设计原则设计了51对引物（表1）。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.2.3SSR-PCR反应体系的建立及优化

PCR扩增体系。PCR反应体系采用正交设计优化的方法，对引物和DNA模板量2个因素进行3个水平的优化，共9个处理。Taq PCR Master Mix用量根据本实验室资料直接套用。引物选用XYZ1。PCR反应因素水平间表2。最终反应体系见表3。

温度梯度PCR。为确定引物最佳退火温度，根据已优化的PCR反应体系，在耶拿公司的Power Cycler PCR仪上进行温度梯度PCR。温度梯度设定为48.5-60.0℃，自动生成12个温度梯度：48.5、48.8、49.6、50.8、52.2、53.5、55.0、56.3、57.7、58.9、59.7、60.0℃。

PCR反应条件：①94℃预变性5 min；②94℃变性30 s；③55℃退火30 s；④72℃延伸30 s；⑤②-④重复34个循环；⑥72℃延伸10 min；⑦4℃保存。

1.2.4引物筛选及反应体系的验证

利用已建立的优化体系和程序，随机选取两个生态类型小叶章DNA，对51对SSR引物进行筛选。选出电泳条带清晰，重复性好，稳定性高，且表现出较好多态性的引物。合成SSR荧光引物，对两个生态类型10个种群的10个样品进行扩增，利用SSR荧光标记毛细管电泳检测反应体系的重复性及稳定性。

2　结果与分析

2.1反应体系的优化

对正交试验的9个PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图1。1-6号处理几乎看不见条带，7-9号处理能扩增出明显条带。由图1可知，7号处理条带效果较好，条带最清晰，且背景较干净。

2.2引物筛选

利用两个不同生态类型小叶章样品对51对SSR云雾进行初选，结果筛选出46对引物具有扩增产物，其中22对引物在两个居群间表现多态性，多态性频率为43.14％。图2为部分引物筛选的6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。从中选出12对电泳条带清晰，重复性好，稳定性高，且表现出较好多态性的引物用于小叶章群体的SSR标记分析。选出的引物序列、退火温度及扩增条带数见表4。

2.3引物筛选及反应体系的验证

以来自5个不同群落的10个小叶章个体为模板，对12对有效扩增的引物进行PCR扩增。荧光标记引物扩增产物在自动测序仪上扫描鉴定。部分引物扩增结果如图3所示。扩增产物大小与理论产物大小相一致。说明自主引物设计合理，反应体系重复性及稳定性高，筛选出的引物可以于用后期小叶章SSR分子标记遗传多样性分析。

2.4引物多态性分析

筛选出12对SSR引物对10个小叶章个体进行PCR扩增，共扩增出24条清晰度高、重复性好的条带，扩增片段长度为150 bp-300 bp，平均每对引物扩增出2条条带，其中16条为多态性条带，多态位点百分率为66.67％。

表1　小叶章57对自主设计SSR引物信息

表2　SSR-PCR反应正交试验设计L9（23）

表3　PCR扩增反应体系

图1　XYZ1引物对小叶章样品的正交试验产物电泳图

图2　部分SSR引物在两个小叶章居群中的多态性

3　讨论

SSR反应体系的建立、优化以及引物筛选是研究植物SSR分子标记的基础和依据。影响SSR反应的主要因子是Mg2+浓度、DNA浓度、dNTP、引物浓度、Taq酶等。本研究采用了商品化的Taq PCR Master Mix，仅对DNA浓度和引物浓度两个因素进行正交试验，缩短了体系优化时间。已报道的研究结果表明，不同物种和不同分子标记方法，各因素对PCR反应的影响作用不同［13，14］。本研究结果表明，模板浓度在60ng以上对小叶章DNA扩增结果较好。

SSR标记的前提条件是必须已知物种DNA序列才能设计引物进行PCR扩增，因此，种属特异的SSR引物开发成为研究关键［15］。本研究通过生物信息学分析，设计了51对小叶章SSR引物，其中有22对表现出多态性。筛选出的12对小叶章SSR引物在10个样品中均有特异性条带被扩增出来，并且特异条带大小与理论条带大小相一致，表明引物具有良好的稳定性和较高的多态性。但筛选引物数量偏少，仍不能满足研究需要。后续试验应继续筛选出更多SSR位点，加大小叶章SSR引物开发设计工作，为小叶章遗传多样性分析奠定基础。

表4　筛选出的引物序列

［1］倪红伟.三江平原湿地植物多样性研究［D］.东北师范大学，博士后出站报告，2001.

［2］高俊琴，吕宪国，李兆富.三江平原湿地冷湿效应研究［J］.水土保学报，2002，16（4）：149-151.

［3］Leigh M G，Jason MN，John G C.Changes in vegetation patterns on the margins of a constructed wetland after 10 years［J］.Ecol. Manage.Rest.2004，5（2）：111-117.

［4］Leo R B，Anthony O G.Response of mid-water common reed stands to water level variations and w inter conditions in Lake Poygan，Wisconsin，USA［J］.Aquat.Bot.2003（76）：49-64.

［5］Charles A C.The assessment of herbaceous plant cover in wetlands as an indicator of function［J］.Ecol.Indicators，2002，2（3）：287-293.

［6］倪红伟，赵玉敏，高玉慧.小叶章居群生产结构及其与微环境因子的关系［J］.国土与自然资源研究，1998（4）：71-73.

［7］邢军会，倪红伟，王建波.二氧化碳浓度升高与氮沉降对三江平原小叶章群落生物量累积及其分配格局的影响［J］.中国农学通报，2011，27（13）：49-54.

［8］杨永兴，王世岩，何太蓉，田昆，杨波.三江平原典型湿地生态系统生物量及其季节动态研究［J］.中国草地，2002，24（1）：522-526.

［9］王丽，胡金明，宋长春，杨涛.波动和静止水文情势下小叶章的生理生态特征［J］.生态学报，2008，28（4）：1794-1801.

［10］高洁，李巧明.羽叶金合欢的DNA提取和SSR引物筛选［J］.云南植物研究，2008，30（1）：64-68.

［11］李小军，冯素伟，李淦，董娜，等.应用SSR分子标记分析小麦品种（系）的遗传重组［J］.作物学报，2013，39（2）：238-248.

［12］王学霞，马静，安永平.SSR标记在水稻种质研究中的应用进展［J］.陕西农业科学，2012（6）：137-140.

［13］张玉平，潘青华，金万梅，等.树莓SSR反应体系的优化及应用［J］.中国农业大学学报，2012，16（6）：58-63.

［14］贾波，徐海滨，徐阳，等.鹅掌楸Genomic-SSR反应体系优化［J］.林业科学研究，2013，26（4）：506-510.

［15］陈怀琼，隋春，魏建和.植物SSR引物开发策略简述［J］.分子植物育种，2009，7（4）：845-851.

（2016-04-16收稿刘晓佳编辑）

SSR Primer Screening and Optimization of Reaction System for Wetland Plant Deyeuxia angustifolia

XU Ming-yi et al
（Institute of Natural Resources and Ecology，HAS.National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation，Harbin 150040，China）

AorthogonaldesignwasusedtooptimizeSSR amplification for Deyeuxia angustifolia in 9 levels of two factors （DNA templateandprimer）．51pairsofSSRprimerswere developed independently.The screened 12 pairs of polymorphic SSR primers were suitable for studying on genetic diversity of Deyeuxia angustifolia.

Deyeuxia angustifolia；SSR molecular markers；Primer screening