乳腺癌中SRA1基因表达调控的生物信息学分析

王　青,傅枭男 ,洪祝平 ,张玉涵 ,郑春红, 王语嫣,丁先锋

(1.浙江理工大学生命科学学院生物工程研究所，杭州 310018;2.浙江经贸职业技术学院应用工程系，杭州 310018)



乳腺癌中SRA1基因表达调控的生物信息学分析

王青1,傅枭男1,洪祝平1,张玉涵1,郑春红1, 王语嫣2,丁先锋1

(1.浙江理工大学生命科学学院生物工程研究所，杭州 310018;2.浙江经贸职业技术学院应用工程系，杭州 310018)

分析类固醇受体RNA激活物(steroid receptor RNA activator, SRA1)以长链非编码RNA形式(lncRNA SRA1)和蛋白质形式(SRA1蛋白)在乳腺癌中的分子调控网络。运用RegRNA、Targetscan、MicroCosm Targets、PicTar软件和HMDD、DAVID在线数据库，预测lncRNA SRA1与microRNA及下游靶基因间的多种调控途径，对靶基因进行功能富集分析，绘制lncRNA SRA1的核心调控网络图。同时运用TCGA数据库、string软件预测分析与SRA1蛋白相互作用的蛋白质。发现lncRNA SRA1上存在hsa-let-7b、 hsa-let-7c、 hsa-let-7g、hsa-let-7i、has-miR-92、has-miR-103、has-miR-194、has-miR-874、has-miR-141、has-miR-146a、has-miR-661这11个与乳腺癌相关microRNA的可能结合位点，从而调节下游230个靶基因，构建了lncRNA SRA1-miRNAs-mRNAs调控网络，提示lncRNA SRA1可能参与基因转录调控、生物合成、MAPK、癌症相关通路、紧密连接等信号通路。并且发现SRA1蛋白和DDX17、ESR1、NCOA2、NCOA1、NRIP1等多种蛋白存在相互作用。对SRA1基因调控网络的生物信息学分析有助于理解其在乳腺癌发生发展过程中的分子机制。

乳腺癌；类固醇受体激活物；lncRNA SRA1-miRNAs-mRNAs;生物信息学

0　引　言

乳腺癌是危害妇女健康的最常见恶性肿瘤之一，据统计，2014年美国的癌症统计研究报告中，大约有23.27万女性罹患乳腺癌，占全部女性所患癌症总人数的29%，位列妇女恶性肿瘤的首位[1]。乳腺癌的科学有效治疗成为临床面临的巨大挑战。

类固醇受体RNA激活物(steroid receptor RNA activator, SRA1)是一种能以长链非编码RNA(lncRNA SRA1)形式和蛋白质形式(SRA1蛋白)调节甾体激素受体活性的分子[2]。目前，多项研究证实，SRA1基因在卵巢癌[3-4]、乳腺癌[4-6]、子宫肿瘤[4]等癌症中异常表达，与肿瘤的发生、发展、预后密切相关。Liu等[3]报道lncRNA SRA1在多囊卵巢综合征患者中比正常显著高表达。Yan等[5]研究发现在雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌患者中，低表达SRA1蛋白患者的生存率较高表达的高，他们推测SRA1蛋白可作为ER+乳腺癌的预后指标。Lanz等[4]通过Northern和荧光定量发现SRA1基因在卵巢肿瘤，子宫肿瘤和乳腺癌组织中较周围组织高表达，尤其在29例乳腺癌组织样本中SRA1基因比对应癌旁样本表达量上调6倍。

然而，这些研究只停留在SRA1基因的表达情况，并没有深入研究其作用机制。SRA1基因作为lncRNA时发挥竞争性内源性RNA作用调控下游miRNA及其靶基因与SRA1蛋白和其他蛋白相互作用的机制并不清楚。运用生物信息学方法预测并分析lncRNA SRA1与下游microRNA及microRNA靶基因间的相互关系，并预测SRA1蛋白和其他蛋白的相互作用，以期为进一步研究SRA1基因的靶基因验证、蛋白质间相互作用以及其生物学功能等的研究提供数据支持和理论指导，为更深层次研究其在乳腺癌发生发展过程中的分子机制提供可靠线索，获得更好的研究乳腺癌的治疗方法。

1　方　法

1.1与lncRNA SRA1相互作用的microRNA预测

运用RegRNA生物学软件预测lncRNA SRA1序列上可能存在的microRNA结合位点(http://regrna.mbc.nctu.edu.tw/html/prediction.html)。在预测lncRNA SRA1与microRNA结合位点时，选取最小折叠自由能(minimum folding free energy，MFE)小于或者等于-25，并且根据lncRNA SRA1与其microRNA配对时的得分，选取score大于或等于150，得分越高，表示lncRNA SRA1-microRNA的结合能力越强。同时，以人类microRNA疾病数据库(HMDD)(http://www.cuilab.cn/hmdd)检索分析与乳腺癌有关的microRNAs,取其交集分析在乳腺癌中可能与lncRNA SRA1相互作用的microRNA。

1.2microRNA靶基因的预测

利用Targetscan (http://www.targetscan.org/vert_50/seedmatch.html)、 PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/)和软件MicroCosm Targets (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/) 预测microRNAs和靶基因上可能的结合位点。为了避免过多的假阳性结果，取至少两个软件预测结果交集，作为进一步结果分析其调控网络。

1.3构建lncRNA SRA1-miRNAs-mRNAs相互作用网络

选取了lncRNA SRA1潜在调控的microRNAs，分别预测每个microRNA调控的靶基因，并利用Cytoscope整合lncRNA SRA1-microRNAs和microRNAs-mRNAs网络，构建成lncRNA SRA1-miRNAs-mRNAs网络调控关系。

1.4microRNA靶基因的功能分析

利用DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)数据库分析靶基因的生物学功能。选择Gene Ontology中的生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function )与细胞组分(cell component)条目和Pathways中的KEGG通路条目，进行分析。

1.5SRA1蛋白string分析

为了进一步分析SRA1蛋白与之相互作用蛋白之间的关系，将SRA1蛋白上传至string数据库(http://string-db.org/)，string数据库可以根据之前的实验数据和预测数据给蛋白之间相互作用的可能性打分，分数越高，表明这两个蛋白之间关联度越高，发生相互作用的可能性就越高。设置可信度 (confidence)为高可信度，score大于或等于0.7，对与SRA1蛋白相关蛋白及其之间相互作用进行分析。

1.6运用公共数据库分析SRA1蛋白在乳腺癌组织中的表达

通过在线工具cBioPortal for Cancer Genomics(http://www.cbioportal.org/) 以肿瘤基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)提供的大量样本，分析SRA1蛋白在乳腺癌组织中的表达情况及其他蛋白随之变化情况。

2　结　果

2.1与lncRNA SRA1相互作用的microRNAs

运用RegRNA生物学软件预测能够与lncRNA SRA1结合的microRNAs共71个。通过HMDD数据库检索，结果显示与乳腺癌有关的有11个microRNAs(hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7g,hsa-let-7i,has-miR-92,has-miR-103,has-miR-194,has-miR-874,has-miR-141,has-miR-146a,has-miR-661)。在这11个microRNAs中，lncRNA SRA1与miR-661配对的得分最高，提示lncRNA SRA1与miR-661结合能力可能最强。因此预测了lncRNA SRA1与miR-661可能形成的配对结构，见图1。从图1中可见该结构由多个发夹结构组成，说明能够形成稳定的结构。并且计算该结构的最小折叠自由能,结果显示MFE为-30.70 kcal/mol，提示该结构具有较低的折叠自由能，lncRNA SRA1与miR-661结合的可能性非常大。

图1　lncRNA SRA1与miR-661可能形成的配对结构

2.2microRNAs的靶基因

运用targetscan, picTar和MicroCosm Targets软件共同分析这11个microRNAs的靶基因，预测有230个靶基因可能受这11个microRNAs调控。各microRNA靶基因的统计结果见图2，其中发现let-7b的靶基因有5个，let-7c的靶基因有5个，let-7g的靶基因有12个, let-7i的靶基因有9个,miR-92的靶基因有5个,miR-103的靶基因有6个,miR-194的靶基因有70个,miR-874的靶基因有36个, miR-141的靶基因有34个,miR-146a的靶基因有27个, miR-661的靶基因有25个。其中miR-194、miR-874和 miR-141的靶基因较多，说明miR-194、miR-874和 miR-141参与更为复杂的调控通路。并且发现miR-146a和miR-661

图2　microRNAs调控靶基因统计图

共同调控白介素1受体相关激酶1(IRAK1)基因，let-7b和miR-874共同调控L型钙通道α1亚单位基因(CACNA1D)，miR-141和miR-194共同调控转录因子分析叉头框蛋白A1基因(FOXA1)和色素域解旋酶DNA结合蛋白(CHD9)基因。

2.3lncRNA SRA1-miRNAs-mRNAs相互作用网络

在建立lncRNA SRA1-miRNAs调控网络的基础上，增加了miRNAs-mRNAs网络，最终建立了lncRNA SRA1在乳腺癌中的lncRNA SRA1-miRNAs-mRNAs调控网络，如图3所示。从图中可以看出该网络总共由242个节点和245条边组成，242个节点代表lncRNA SRA1,11个miRNAs和230个mRNAs，其中菱形代表lncRNA SRA1，三角形代表microRNA ，圆形代表microRNA靶基因，245条边表示它们之间存在245种相互作用关系。lncRNA SRA1在该网络的中心，调节与之结合的hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7g、hsa-let-7i、has-miR-92、 has-miR-103、 has-miR-194、has-miR-874、has-miR-141、has-miR-146a、has-miR-661这11个miRNAs，进而调控下游230个靶基因。所有相关基因构成一个复杂的网络调控，相互协调，提示lncRNA SRA1可能从不同的层面上参与乳腺癌细胞的发生发展过程。

图3　lncRNA SRA1-miRNA-mRNA调控网络注：菱形代表lncRNA SRA1，三角形代表microRNA，圆形代表microRNA靶基因。

2.4microRNAs靶基因的GO和pathway功能富集分析

为了进一步从总体上了解乳腺癌中lncRNA SRA1的生物学功能，将参与lncRNA SRA1-miRNAs-mRNAs的230个microRNA靶基因映射到DAVID数据库，进行GO和KEGG pathway功能聚类分析，推测lncRNA SRA1可能参与的生物过程以及所在的信号通路。在microRNA的靶基因GO分析中，结果显示：在生物学过程中，microRNA靶基因高度富集到转录调节、RNA代谢、磷酸化、DNA结合等过程，见图4。在microRNA的靶基因KEGG pathway分析中，microRNA靶基因高度富集到MAPK信号通路，癌症相关通路，紧密连接和轴突导向信号转导通路。

图4　microRNA靶基因的GO聚类分析

2.5SRA1蛋白相互作用调控网络

采用string在线软件,分析提示SRA1蛋白和DDX17、ESR1、NCOA2、NCOA1、NRIP1、CREBBP、PPARA、EP300、MED1、ACOX1、NR1H3、APOA1、 ME1、HSD17B4、APOA2、CITED2、LPL、FABP1、CPT1A和PPARGC1A等多种蛋白存在相互作用。由图5可知，SRA1蛋白处于网络的中心，多种蛋白之间存在密切复杂的相互作用关系，为深入研究SRA1蛋白提供了一定的线索。

同时利用cBioPortal软件通过TCGA大量样本分析乳腺癌相关基因表达情况，结果显示SRA1基因在9.1%(n=507)乳腺癌患者中变异。进一步

图5　以SRA1为中心的蛋白网络

分析蛋白表达情况，发现SRA1蛋白的突变在乳腺癌中与ESR1蛋白的表达量下调显著相关(P=0.0009)(图6)。说明SRA1蛋白可能通过和ERS1相互作用，调控下游基因的表达，参与乳腺癌发生发展过程。从蛋白质相互作用网络出发，在蛋白质水平宏观分析乳腺癌发病的整体联系，能更客观的发现乳腺癌发生发展的关键靶点。

图6　ESR1蛋白随SRA1蛋白在乳腺癌中变化　注:改变代表SRA1蛋白改变的样本，未改变代表SRA1蛋白没有改变的样本。

3　讨　论

近年来，随着对肿瘤的深入研究，人们逐步认识到许多分子和蛋白与肿瘤的发生发展密切相关。SRA1是首次发现的可以从RNA和蛋白质两个水平上发挥功能的分子。目前对lncRNA SRA1和SRA1蛋白的功能研究较少，尤其在乳腺癌中lncRNA调控miRNA方面的报道更为少见。

lncRNA SRA1参与复杂的调节过程。lncRNA通过多种机制在染色质重塑、转录调控、转录后调控和翻译调控等生命活动中发挥功能。2011年，Pandolfi教授领导的课题组提出了竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)假说[7]。该假说认为mRNA, lncRNA等转录物可以竞争性结合一些相同的微小RNA，从而相互影响彼此的表达水平。Wang等[8]的研究表明lncRNA HULC具有miR-372的结合位点，可以作为一种内源性“海绵”，HULC的高表达可以使miR-372的表达水平降低，导致miR-372靶基因Prkacb的表达上调，最终使得CREB磷酸化，促进PKA信号通路，促进肝癌的发生。Maxim等[9]研究了新型lncRNA BARD1 9’L在多种癌症发生发展中的作用，发现BARD1 9’L mRNA的3’-UTR能竞争性结合miR-203和miR-101，从而调控肿瘤抑制基因BARD1的表达水平，促进癌细胞的增殖和迁移。虽然类似这样的例子在乳腺癌中也有描述[10]，但多角度关于lncRNA SRA1的调控，尤其是可能存在lncRNA SRA1-miRNA相互作用，这需要进一步研究。利用RegRNA软件预测与lncRNA SRA1结合的靶microRNA，再结合HMDD数据库分析，发现在乳腺癌中有11个microRNAs可能受lncRNA SRA1调控，其中miR-141、miR-146a和miR-661研究相对广泛，同时运用生物学软件预测这11个microRNAs的靶基因，发现有230个靶基因可能受这11个microRNAs调控，最终建立了lncRNA SRA1在乳腺癌中的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。如果其中任何一个基因表达失调也许会使得多个信号通路发生改变，从而促使乳腺癌的发生。此外，根据ceRNA假说对lncRNA SRA1的功能进行了预测，发现lncRNA SRA1可能影响RNA的转录、神经分化、磷代谢过程、MAPK信号通路等多种生物学功能，这有利于生物学家更有针对性地锁定感兴趣的靶基因并对其进行研究，为阐明SRA1基因的生物学功能提供了数据支持和理论指导。

长期以来，类固醇受体激活物SRA1基因被认为作为非编码转录产物发挥活性[11]，但Hube研究发现如果SRA1前体选择另一种剪切方式，将会产生mRNA，翻译出SRA1蛋白[12]。一系列研究发现SRA1的lncRNA形式主要与类固醇激素受体辅激活物SRC-1结合发挥转录共激活作用[11]。SRA1的蛋白质形式也具有类似的功能，但是不同于RNA形式，SRA1蛋白可结合到特定基因的启动子区域，并起到抑制物的作用。Kawashima改变SRA1蛋白的开放阅读框序列来阻遏SRA1蛋白的表达，促使调节功能丧失，同时发现SRA1蛋白在体外能直接结合雄激素受体AR的激活功能区AF-2[13]。SRA1蛋白的异常表达参与肿瘤细胞的发生、发展，并且影响患者的生存率。因此，运用生物学软件预测SRA1蛋白与其他蛋白的相互关系，发现SRA1蛋白和许多蛋白之间都存在直接或间接的相互作用，这也提示了生物调控网络具有多层次和复杂性。此外，通过TCGA数据库得到507例乳腺癌患者测序信息，发现SRA1蛋白的突变在乳腺癌中与ESR1蛋白的表达量下调显著相关(P=0.0009)。虽然目前在乳腺癌研究上已取得一定成果，但其中很多复杂的蛋白之间相互作用仍未被发现，这需要更深入的研究。

SRA1基因能以长链非编码RNA和蛋白质两个形式发挥功能，但在乳腺癌发生、发展中什么阶段是在长链非编码RNA水平上发挥作用，什么阶段在蛋白质水平上起作用，两者之间又是如何相互协调的,这都是需要进一步去解决的问题。虽然构建了lncRNA SRA1-miRNAs-mRNAs调控网络和分析了SRA1蛋白与其他蛋白的相互作用，但也存在一定的局限性。一方面，由于各种预测软件具有一定的局限性，预测结果存在假阳性。另一方面，以上结果仅仅是从生物信息学角度分析而来，还需要进一步的实验验证，以获得更可信的结果。

4　结　论

利用生物信息学方法，研究发现lncRNA SRA1上存在11个与乳腺癌相关microRNA的可能结合位点和230个microRNA靶基因，构建了lncRNA SRA1紧密复杂的基因表达调控网络，并根据竞争性内源假说预测lncRNA SRA1的功能，结果显示lncRNA SRA1可能参与基因转录调控、生物合成、MAPK等信号通路。同时构成以SRA1蛋白为中心的蛋白质网络，并且SRA1蛋白可能通过和ERS1相互作用，调控下游基因的表达，为研究其在乳腺癌发生发展中的分子机制及后续实验提供新思路。

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(责任编辑： 许惠儿)

Bioinformatic Analysis ofSRA1 Gene in Breast Cancer

WANGQing1,FUXiaonan1,HONGZhuping1,ZHANGYuhan1,ZHENGChunhong1,WANGYuyan2,DINGXianfeng1

(1.Institute of Bioengineerning , College of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China; 2. Department of Application Engineering,Zhejiang Economic & Trade Polytechnic, Hangzhou 310018, China)

To predict the regulatory network of SRA1 both at RNA and protein level in breast cancer by the methods of bioinformatics. The RegRNA，Targetscan，MicroCosm Targets, PicTar bioinformatics applications and HMDD，DAVID databases were employed to predict the interaction between lncRNA SRA1 and microRNAs. At the same time, TCGA database and string application were utilized to develop the SRA1-centric proteins network. The potential binding sites of 11 miRNAs (hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7g, hsa-let-7i, has-miR-92, has-miR-103, has-miR-194, has-miR-874, has-miR-141, has-miR-146a, has-miR-661) on lncRNA SRA1 sequence, and 230 target genes of the 11 miRNAs were found. The results indicated that the lncRNA SRA1 may play some parts in transcription, biosynthetic process, MAPK signaling pathway, cancer related pathways and tight junction. In addition, it also showed SRA1 protein interacted with multitude proteins. It was demonstrated that the regulatory network of SRA1 by bioinformatics provided reliable clues for exploring the molecular mechanisms ofSRA1 gene in breast cancer.

breast cancer; steroid receptor RNA activator; lncRNA SRA1-miRNAs-mRNAs; bioinformatics

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.03.021

2015-07-30

国家自然科学基金项目(11105121)；浙江省自然科学基金项目(LY15C050002)；浙江省创新团队项目(2014R406078)；浙江经贸职业技术学院大学生创新项目(20140421)

王青(1991-)，女，江苏盐城人，硕士研究生，主要从事肿瘤非编码RNA方面的研究。

丁先锋，E-mail: xfding@zstu.edu.cn

Q786

A

1673- 3851 (2016) 04- 0283- 07 引用页码： 030703