邓恩桉遗传多样性的ISSR分析

邓紫宇，郭东强，陈健波，罗 清，项东云

(1.广西壮族自治区林业科学研究院，广西 南宁 530001； 2.国家林业局中南速生材繁育实验室，广西 南宁 530001； 3.广西优良用材林资源培育重点实验室，广西 南宁 530001；4.广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁 530001)

邓恩桉遗传多样性的ISSR分析

邓紫宇1，2，3，郭东强1，2，3，陈健波1，2，3，罗 清4，项东云1，2，3

(1.广西壮族自治区林业科学研究院，广西 南宁 530001； 2.国家林业局中南速生材繁育实验室，广西 南宁 530001； 3.广西优良用材林资源培育重点实验室，广西 南宁 530001；4.广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁 530001)

探讨邓恩桉亲缘关系及遗传多样性，为其种质资源利用和分子育种提供参考。利用ISSR分子标记技术分析邓恩桉6个种源遗传多样性。筛选出8条特异引物共扩增90条清晰条带，其中76条为多态条带，多态性比率为84.44%，平均等位基因观察值为1.8444，平均有效等位基因为1.4928，基因多样性指数为0.2879，Shannon信息指数为0.4306。6个邓恩桉种源遗传相似系数在0.7271～0.8719之间，平均相似系数为0.7926。UPGMA聚类分析发现，在相似系数为0.80时邓恩桉6个种源可划分为2个类群。邓恩桉种源间遗传多样性差异较小，聚类结果与邓恩桉种源地理分布密切相关。

邓恩桉；遗传多样性；ISSR

邓恩桉(Eucalyptusdunnii)天然分布于澳大利亚新南威尔士州东北部及昆士兰州东南部，由于分布区域有限，天然林面积小，在澳大利亚邓恩桉被列入稀有树种行列[1-2]。邓恩桉生长快、干形好、材质优、具有较好的抗寒性能，可作为纸浆材和轻型建筑用材[3-4]，是我国低海拔夏雨型凉冷地区桉树人工林主要栽培树种。为追求获得快速的经济利益，我国桉树人工林绝大部分采用短轮伐期经营，造成了一定的生态问题，培育桉树中大径材不仅可以缓解生态压力而且还能提高经济效益，邓恩桉是培育中大径材较好的树种。

ISSR(inter-simple sequence repeat)是目前应用较广的分子标记技术，其多态性源于基因组中简单序列重复多态性，克服了RFLP标记技术限制的同时结合RAPD和SSR标记的优点，操作简便、快捷，实验稳定，结果可靠。

近年来，我国南方受冬季霜冻影响，桉树人工林损失严重，耐寒桉树种邓恩桉成为桉树育种研究的重点，其研究主要集中在木材性能[5-9]、抗寒性能[10-11]以及植物组织培养[12-13]等方面。分子标记技术已广泛应用于桉树群体多样性分析[14-17]，曾艳玲等[18]对包括邓恩桉在内的8份桉树材料进行ISSR分析，并将邓恩桉与赤桉分为一类，但邓恩桉群体多样性研究未见报道。因此，笔者对引种的2个邓恩桉天然分布区内6个种源间伐后保存的优良育种群体利用ISSR标记技术探讨其亲缘关系及遗传多样性，为今后从分子水平开展邓恩桉材性和抗寒性能研究及合理保护利用邓恩桉种质资源和良种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料取自环江县华山林场雅龙分场2009年建立的邓恩桉种源试验林(表1)，参试的6个邓恩桉种源分别来自昆士兰州(2个)和新南威尔士州(4个)。

表1 邓恩桉种源基本信息

1.2 样品采集及基因组DNA提取

每个种源选取长势良好的12个单株进行取样，共计72份材料，采集幼嫩叶片立即密封并置于放有冰袋的冰盒中，带回实验室于-72 ℃保存备用。

72份材料基因组DNA的提取采用改良CTAB法，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳初步检测样品DNA的浓度与纯度(图1)，用核酸检测仪进行定量检测并将样品DNA稀释至50 ng·μL-1，保存于-20 ℃。

图1 邓恩桉基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果图2 引物UBC848扩增结果

1.3 ISSR-PCR扩增

ISSR-PCR反应体系经过比较和优化确定为20 μL，包括1×buffer、1U Taq酶、2.0 mmol·L-1MgCl2、0.1 mmol·L-1dNTP、0.5 mmol·L-1引物、25 ng模板DNA。ISSR-PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min，然后进行30个循环，94 ℃变性30 s，52 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，循环结束后72 ℃延伸1 min，最后4 ℃保存。选取2个模板DNA进行引物筛选，筛选出扩增条带多、条带清晰的引物用于ISSR-PCR扩增，扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶于150 V恒定电压下电泳1 h左右，电泳结果可通过自动凝胶成像系统进行拍照(图2)。

100个ISSR引物选自加拿大大不列颠哥伦比亚大学(UBC)公布的随机引物，引物合成及相关试剂药品购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 数据处理

统计电泳条带，按照条带的有无赋值，扩增条带无记为“0”，有记为“1”，记录原始“0/1”矩阵，建立72份材料的ISSR识别卡。利用POPGENE 32和NTSYS 2.1遗传分析软件对“0/1”矩阵进行种源水平遗传多样性分析，并用UPGMA(非加权算术平均聚类)进行聚类，数据格式输入及软件使用参照说明书。

2 结果与分析

2.1 扩增产物多态性分析

8条特异引物共扩增出90条谱带，其中多态性谱带76条，平均每条引物扩增9.5条多态性谱带，多态性比率为84.44%(表2)，表明72份材料之间存在遗传差异。其中引物UBC835、845、848扩增带数最多，为13条谱带，引物835、848、856多态性比率最高，为100%。在扩增出的90条谱带中包括14条各个基因型共有的谱带，为72份材料同源性分析提供了一定的依据。

表2 ISSR引物的碱基序列及扩增结果

2.2 遗传多样性分析

90个位点检测到的平均等位基因观察值为1.8444，平均有效等位基因为1.4978，基因多样性指数为0.2879，Shannon信息指数为0.4306，表明邓恩桉6个种源遗传多样一般。6个邓恩桉种源遗传相似系数在0.7271～0.8719之间，平均相似系数为0.7926；遗传距离在0.1371～0.3187之间，平均遗传距离为0.2338(表3)。表明邓恩桉6个种源具有较高的同源性。

表3 邓恩桉种源间的Nei′s遗传一致度与遗传距离

*：对角线上方为遗传一致度；对角线下方为遗传距离。

2.3 聚类分析

UPGMA聚类分析显示(图3)：在相似系数为0.80时，来自昆士兰州的2个邓恩桉种源与来自新南威尔士州的4个邓恩桉种源被划分为2大类；在相似系数为0.83时，来自新南威尔士州的4个邓恩桉种源又被划分为2类，其中纬度较低的种源GED9501与GED9507归为一类，纬度较高的种源GED9502与GED9509归为一类，说明地理分布是影响聚类结果的重要因子。遗传距离最近(0.1371)的种源为GED9501与GED9507，遗传距离最远(0.3187)的种源为GED9502 与GED9504。

3 结论与讨论

3.1 遗传多样性分析

遗传多样性实际就是群体之间的差异性或者个体之间的差异性，通过分子标记技术探讨物种的遗传多样性比表型观测更为准确可信，因为它揭示的是物种基因的多样性。巨桉[14]、韦塔桉[15]、细叶桉[16]和大花序桉[17]等已开展遗传多样性的分子标记分析，利用分子标记技术揭示桉树基因多样性是可行的。本研究通过ISSR标记分析邓恩桉6个种源遗传多样性，84.44%的多态性比率表明邓恩桉72个个体之间存在较丰富的遗传变异，4个多样性指标则表明邓恩桉6个种源遗传基础较窄，具有较高的同源性，原因在于本次采样仅针对华山林场雅龙分场种源试验林间伐后保存的优良育种群体。

罗建中等[5]指出邓恩桉遗传差异主要存在于家系间，邓恩桉种源间遗传差异小。邓恩桉相对其他桉属树种，其自然分布区域小，仅分布在澳大利亚新南威尔士州东北部和昆士兰州东南部的有限区域内，造成邓恩桉种源间差异小，而邓恩桉的生长极易受到种植环境的影响，这可能是邓恩桉在个体间存在丰富差异的原因。在今后邓恩桉遗传改良中，应重视家系水平改良，针对不同造林地点选择优良材料。

3.2 聚类分析

聚类分析可揭示不同个体之间的亲缘关系，邓恩桉在其自然分布区域呈不连续分布，成为2个完全独立的群体，本研究中，这2个独立的群体首先被区分开来，在进一步聚类分析中，来自新南威尔士州的4个邓恩桉种源被划分为2类，一类为高经度、低纬度、高海拔种源，一类为低经度、高纬度、低海拔种源。种源GED9501与GED9507遗传距离最近，它们都来自新南威尔士州且地理因素相近；种源GED9502 与GED9504遗传距离最远，它们分别来自新南威尔士州和昆士兰州的两个独立群体，两者地理因素比较，种源GED9502为低经度、高纬度、低海拔，种源GED9504为高经度、低纬度、高海拔。邓恩桉地理变异与种源间基因变异有关，地理分布是影响聚类结果的重要因子，这与大花序桉[17]、杉木[19-20]和铁兰属植物[21]研究结论相似。

[1]王豁然.桉树生物学概论[M].北京：科学出版社，2010.

[2]Boland D J，Brooker M I H，Chippendale G M，et al.Forest trees of Australia[M].5th ed.Collingwood：Csiro Publishing，2006：398.

[3]祁述雄.中国桉树[M].北京：中国林业出版社，2002.

[4]Thomas D，Henson M，Joe B，et al.Review of growth and wood quality of plantation-grown Eucalyptus dunnii Maiden[J].Australian Forestry，2009，72(1)：3-11.

[5]罗建中，Roger Arnold，项东云，等.邓恩桉生长、木材密度和树皮厚度的遗传变异研究[J].林业科学研究，2009，22(6)：758-764.

[6]任世奇，罗建中，彭彦，等.17年生邓恩桉两个种源木材密度与干缩性研究[J].亚热带植物科学，2010，39(2)：5-9.

[7]叶露，J.Doland Nichols，Carolyn A.Raymond，等.邓恩桉生长特性与生长应变研究[J].安徽农业科学，2013，41(10)：4409-4410，4418.

[8]郭东强，叶露，周维，等.2个种源邓恩桉木材纤维特性及变异[J].浙江农林大学学报，2014，31(4)：502-507.

[9]卢翠香，陈建波，刘媛，等.邓恩桉生材含水率、年轮宽度及木材密度研究[J].桉树科技，2014，31(2)：23-27.

[10]郭祥泉，朱会芸，洪伟，等.极端低温分布模型在邓恩桉抗寒性标注定量化应用的研究[J].热带亚热带植物学报，2011，19(1)：51-55.

[11]郭祥泉，吴奇智，洪伟，等.应用电导率探讨邓恩桉不同优株的抗寒性[J].亚热带植物科学，2012，41(1)：41-44.

[12]管朝旭，施彬，曾德贤，等.邓恩桉组培技术研究[J].桉树科技，2012，29(4)：20-28.

[13]谭柏韬，李茂娟，邓少华.邓恩桉再生系统的研究[J].中国农学通报，2013，29(31)：32-35.

[14]李志辉.巨桉引种栽培及遗传多样性研究[D].株洲：中南林学院，2001.

[15]潘天玲，刘友全，李坤平.RAPD标记在韦塔桉种源遗传结构上的应用[J].生命科学研究，2003，7(1)：89-94.

[16]张党权，田华，谢耀坚，等.细叶桉遗传多样性的ISSR分析[J].中南林业科技大学学报，2009，29(5)：91-94.

[17]邓紫宇.利用SSR分子标记研究大花序桉遗传结构[D].南宁：广西大学，2012.

[18]王鹏良.马尾松无性系种子园多年份子代遗传多样性分析[D].南京：南京林业大学，2006.

[19]欧阳磊，陈金慧，郑仁华，等.杉木育种群体SSR分子标记遗传多样性分析[J].南京林业大学学报：自然科学版，2014，38(1)：21-26.

[20]徐阳，陈金慧，赵亚琦，等.杉木地理种源的EST-SSR分子标记变异研究[J].南京林业大学学报：自然科学版，2014，38(1)：1-8.

[21]宿静，李玉萍，汤庚国.34种铁兰属植物亲缘关系的SRAP分析[J].南京林业大学学报：自然科学版，2013，37(5)：153-156.

Genetic Diversity ofEucalyptusdunniiBased on ISSR

DENG Ziyu1，2，3，GUO Dongqiang1，2，3，CHEN Jianbo1，2，3，LUO Qing4，XIANG Dongyun1，2，3

(1.GuangxiForestryScienceResearchInstitute，Nanning530001，Guangxi，China； 2.KeyLaboratoryofCentralSouthFast-growingTimberCultivationofStateForestryAdministrationofChina，Nanning530001，Guangxi，China；3.GuangxiKeyLaboratoryofSuperiorTimberTreesResourceCultivation，Nanning530001，Guangxi，China；4.GuangxiSubtropicalCropsResearchInstitute，Nanning530001，Guangxi，China)

The paper focused on assess the genetic diversity and variability ofEucalyptusdunniito provide referents for resource utilization and molecular breeding.ISSR marker was used to study the genetic diversity of 6Eucalyptusdunniiprovenances.A total of 90 bands were amplified by 8 primers，of which 76 are polymorphic bands(84.44% of polymorphism).The average value of observed number of alleles，average value of effective number of alleles，Nei′s gene diversity and Shannon′s information index were 1.8444，1.4928，0.2879 and 0.4306 respectively.The Nei′s genetic similarity coefficients ranged from 0.7271～0.8719 with an average of 0.7926.According to the UPGMA method，we made the cluster analysis by using the NTSYS software，6Eucalyptusdunniiprovenances could be divided into two groups at the similarity coefficient of 0.80.The genetic diversity among inter-provenances ofEucalyptusdunniiwas lower，and the geographical distribution ofEucalyptusdunniiwas closely related to the cluster result.

Eucalyptusdunnii；genetic diversity；ISSR

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.04.004

2016-01-03；

2016-03-01

广西科学研究与计划开发项目(桂科合1347004-3)；广西优良用材林资源培育重点实验室自主课题项目(13-A-01-02)；广西林科院基本科研业务费项目(林科201408号)

邓紫宇(1984—)，男，广西全州人，广西壮族自治区林业科学研究院工程师，硕士，从事林木遗传育种研究。E-mail：365204914@qq.com。

项东云(1960—)，男，广西扶绥人，广西壮族自治区林业科学研究院教授级高级工程师，从事林木遗传育种研究。E-mail：1753306481@qq.com。

S792.39

A

1002-7351(2016)04-0017-04