氮、磷对热带海洋富油微藻Desmodesmus sp.WC08生长及油脂积累的影响

罗　宁，张　森，刘平怀（海南大学，教育部热带多糖资源利用工程研究中心/热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南海口570228）

氮、磷对热带海洋富油微藻Desmodesmus sp.WC08生长及油脂积累的影响

罗宁，张森，刘平怀*
（海南大学，教育部热带多糖资源利用工程研究中心/热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南海口570228）

为研究氮源、氮浓度及磷浓度对一株富油海水藻株Desmodesmus sp.WC08生长和油脂积累的影响。以BG11为基本培养基，考察亚硝酸钠、硝酸钠、尿素及氯化铵以及不同尿素浓度和磷浓度对Desmodesmus sp.WC08生长、油脂积累影响。结果表明：除氯化铵外，不同氮源对Desmodesmus sp.WC08生长影响较小，以尿素为氮源时，生长和油脂积累最佳；Desmodesmus sp.WC08生长和油脂积累的最佳氮浓度为10 mmol/L，过高或过低都将影响其生长和油脂积累；Desmodesmus sp.WC08的生长和油脂积累随着磷浓度的升高先增加后降低，最佳磷浓度为0.5 mmol/L；在最佳氮浓度和磷浓度下，Desmodesmus sp.WC08对氮、磷的吸收较完全，能够充分利用培养基中的营养物质。

Desmodesmus sp.WC08，氮源，氮浓度，磷浓度，营养吸收

微藻是一类油脂含量高的微生物，大多数微藻的油脂含量可达干重的20%～50%［1］。化石燃料的短缺及其对环境的污染，使得富油微藻逐渐成为全世界的能源工作者关注的对象［2］。与传统的油料作物相比，微藻具有高生长速率，高油脂产率，以及不占用耕地等优势［3］。尽管微藻具有众多优势，但是高密度培养成本依然是微藻成为商业化生物柴油原料的瓶颈［4］，因此探索微藻高密度生长和油脂积累的影响因素具有很重要的意义。氮是生物体内蛋白质和核酸的基本组成元素，对微藻的生长和油脂积累具有调控作用。Scenedesmus sp.CCNM 1077［5］在氮胁迫情况下形态结构发生变化，油脂含量和多糖均达到最大，分别为干重的27.93%和45.74%。利用污水培养Chlorella sorokiniana［6］，当添加尿素为氮源时生长最好，尿素浓度为1.5 g/L时，生物量可达0.218 g/L，油脂含量高达61.52%。磷参与光合作用，是合成ATP的重要元素之一，对微藻的生长和油脂积累同样有较大的影响。Rhopalosolen saccatus［7］在磷限制下脂肪酸成分有显著变化，但是生物量和总脂积累无显著影响，江淮真等［8］发现小球藻在缺磷条件下总脂和中性脂含量均逐渐增大。

Desmodesmus sp.WC08是分离自海南岛的一株高生物量且油脂含量较高的链带藻，目前对链带藻的研究已有从自然条件［9］（温度、光照强度、光照周期和pH）及营养元素［10］（铁、钙和镁）优化链带藻的培养条件，同时也可利用污水中的营养物质培养链带藻［11］。本研究以Desmodesmus sp.WC08为对象，初步考察氮源、氮浓度及磷浓度对Desmodesmus sp.WC08生长和油脂积累的影响，为Desmodesmus sp.WC08的高密度培养及其油脂开发提供研究基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

链带藻（Desmodesmus sp.WC08） 海南大学生物工程综合实验室提供；粗海盐购自海南莺歌海盐场；硝酸钠、亚硝酸钠、尿素、氯化铵、磷酸氢二钾、氯仿及甲醇等均为国产分析纯。

TU-1810紫外可见分光光度计北京普析通用；CR-22G II离心机日立；LDJ-25C冷冻干燥系统北京四环科学仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅 日本SANYO；柱状玻璃管高60 cm，直径5 cm。

1.2培养基及培养条件

培养基为BG11，每升水中含有1.5 g NaNO3，0.04 g K2HPO4，0.075 g MgSO4·7H2O，0.036 g CaCl2·H2O，0.006 g柠檬酸，0.006 g柠檬酸铁铵，0.02 g NaCO3，0.001 g EDTA·Na2，2.860 g H3BO3，0.220 g ZnSO4·7H2O，1.810 g MnCl2·4H2O，0.079 g CuSO4·5H2O，0.049 g Co（NO3）2·6H2O，0.390 g Na2MoO4·2H2O。

柱状培养管中装0.5 L培养液，接种比例1∶10（V/V），连续光照，光照强度为8000～10000 lx，室温下培养，并通入无菌空气，通气比为0.25，培养周期为18 d。

1.3实验设计

1.3.1氮源对Desmodesmus sp.WC08生长及油脂含量的影响培养基（除氮源外）按BG11培养基配制，海盐浓度为15 g/L，分别用BG11配方中相同氮摩尔浓度（18 mmol/L）的硝酸钠，亚硝酸钠，尿素和氯化铵作为唯一氮源，每组实验设计三组平行。

1.3.2氮浓度对Desmodesmus sp.WC08生长及油脂含量的影响分别以氮摩尔浓度为5、10、15、20、30 mmoL/L的尿素为氮源，其他成分按BG11培养基配制，海盐浓度为15 g/L，每组实验设计三组平行。

1.3.3磷浓度对Desmodesmus sp.WC08生长及油脂含量是影响分别以磷摩尔浓度为0.1、0.3、0.5、0.8、1.2 mmoL/L的磷酸氢二钾为磷源，其他成分按BG11培养基配制，海盐浓度为15g/L，每组实验设计三组平行。1.4分析方法

1.4.1生长检测培养周期为18 d，培养过程中每48 h取样一次，在680 nm下测定藻液的吸光值。

1.4.2生物量浓度测定将培养18 d后的藻液于8000 r/min离心6 min，将所得藻泥用去离子水清洗3遍，采用真空冷冻干燥法进行干燥。生物量浓度计算公式为：

生物量浓度（g/L）=冻干藻粉（g）/培养液体积（L）1.4.3油脂含量测定参照文献［12］氯仿-甲醇法对总脂进行提取和测定。称取一定量的冻干藻粉，放入带塞玻璃管中，加入2 mL的氯仿-甲醇溶液（氯仿∶甲醇为2∶1，v/v），常温下磁力搅拌30 min，4000 r/min离心5 min，收集上清液，余下藻渣重复上述步骤重复提取一次，合并所有有机相，加入0.2倍体积的0.9% NaCl，离心分层收集下层氯仿层至干净玻璃瓶中，氮吹仪吹干至恒重。计算公式如下：

油脂含量（%）=油脂质量（g）/藻粉质量（g）×100油脂产量（g/L）=生物量（g/L）×油脂含量（%）

1.4.4氮、磷含量测定总氮按照碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定，总磷按照钼酸铵分光光度法测定。

1.4.5数据处理与分析分别采用SPSS 20.0和Oringin 8.0软件对数据进行分析和图形绘制。

2　结果与讨论

2.1氮源对Desmodesmus sp.WC08生长及油脂含量的影响

图1　Desmodesmus sp.WC08在不同氮源中的生长曲线Fig.1　Growth curve of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different nitrogen sources

微藻对不同形式氮源的吸收利用存在一定的差异，对氮的利用先后顺序一般为铵态氮、其次为硝态氮和亚硝态氮［13］。由图1可以看出，Desmodesmus sp. WC08在以硝酸钠、亚硝酸钠、尿素和氯化铵为氮源时，具有明显的生长差异。以尿素为氮源时，生长最快，其次为亚硝酸钠和硝酸钠，二者差异较小。以氯化铵为氮源时，培养7 d后，不再生长且开始死亡，第8 d时基本全部死亡，其可能由于NH4+的消耗致使培养液pH快速下降导致，培养结束时，培养液pH为3.24，此结果和以往的研究结果一致［14］。培养18 d后生物量见表1，尿素组的生物量最高，其次依次为亚硝酸钠和硝酸钠组，氯化铵组由于藻体死亡，未能测定生物量。ANOVA分析表明，尿素、硝酸钠及亚硝酸钠对Desmodesmus sp.WC08的生物量积累无显著影响（p＞0.05）。但以尿素为氮源时，生长最好，生物量最高，可能与尿素不仅能为氮源而且能充当碳源有关。可见，四种不同形式的氮源中，以有机铵态氮的尿素最适宜微藻Desmodesmus sp.WC08生长和生物量积累。

表1　Desmodesmus sp.WC08在不同氮源中的生物量浓度Table 1　Biomass concentration of microalgae Desmodesmus sp. WC08 with different nitrogen sources

不同氮源下Desmodesmus sp.WC08的油脂含量和油脂产量见图2，不同氮源下Desmodesmus sp.WC08的油脂含量无显著差异（p＞0.05），但是对其油脂产量具有显著影响（p＜0.05），其中尿素组的油脂产量最高，其次为亚硝酸钠和硝酸钠，但后两者之间无显著差异（p＞0.05）。以尿素为氮源时生物量和油脂产量均最大，因此在氮浓度实验中选择尿素为氮源。

图2　氮源对Desmodesmus sp.WC08油脂积累的影响Fig.2　Effects of nitrogen sources on the lipid accumulation ofmicroalgae Desmodesmus sp.WC08

2.2氮浓度对Desmodesmus sp.WC08生长及油脂含量的影响

不同浓度的氮源对微藻生长和油脂积累具有非常重要的影响，通常在低氮或缺氮条件下，微藻细胞较易大量积累油脂，但是生长较差，生物量较低［15-16］。如图3所示，Desmodesmus sp.WC08在不同浓度氮中的生长具有显著差异，特别是在生长后期，低浓度氮比高浓度氮更利于Desmodesmus sp.WC08的生长。不同氮浓度对微藻Desmodesmus sp.WC08的生物量积累（表2）具有显著影响，随氮浓度升高，生物量逐渐升高，至10 mmoL/L时，生物量最高，随后生物量逐渐降低，至氮浓度为30 mmoL/L时，生物量最低。说明较高的氮浓度对微藻的生长和生物量积累具有一定的抑制作用。氮浓度为10 mmoL/L时，最有利于Desmodesmus sp.WC08的生长和生物量的积累。

图3　Desmodesmus sp.WC08在不同氮浓度中的生长曲线Fig.3　Growth curve of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different nitrogen concentrations

除了生长和生物量外，氮浓度对微藻细胞内油脂的积累亦具有重要的调控作用。如图4所示，氮浓度对Desmodesmus sp.WC08的油脂含量和油脂产量具有极显著影响，随着氮浓度升高，油脂含量和油脂产量逐渐降低，氮浓度为5 mmoL/L时的油脂含量最高，是油脂含量最低的30 mmoL/L组的1.4倍。氮浓度为10 mmoL/L时，油脂产量最高，5 mmoL/L组次之，二者无显著差异，是30 mmoL/L组油脂产量的2.2倍。

图4　氮浓度对Desmodesmus sp.WC08油脂积累的影响Fig.4　Effects of urea concentration on the lipid accumulation of microalgae Desmodesmus sp.WC08

2.3磷浓度对Desmodesmus sp.WC08生长及油脂含量的影响

磷是除氮元素外，对微藻生长和生化组成最具影响和调控作用的元素之一。Desmodesmus sp.WC08在不同磷浓度下的生长曲线如图5所示，不同磷浓度对其生长具有一定差异，磷浓度为0.3 mmoL/L 和0.5 mmoL/L时，生长最好，低于或高于此浓度范围后，Desmodesmus sp.WC08的生长较差。最终生物量见表3，磷浓度对Desmodesmus sp.WC08的生物量具有显著影响，随着磷浓度的升高，生物量先升高后降低，至浓度为0.5 mmoL/L时，生物量最高，0.3 mmoL/L次之，二者没有显著差异（p＞0.05）。磷浓度为1.2 mmoL/L时，生物量最低，仅为0.5 mmoL/L时的一半，说明高浓度磷不利于Desmodesmus sp.WC08的生长。因此，Desmodesmus sp.WC08最适生长和生物量积累的磷浓度为0.5 mmoL/L。

图5　Desmodesmus sp.WC08在不同磷浓度中的生长曲线Fig.5　Growth curve of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different phosphorus concentrations

Desmodesmus sp.WC08在不同磷浓度下的油脂含量和油脂产量如图6所示，磷浓度对其油脂含量和油脂产量具有极显著影响，其中在低磷浓度（0.1 mmoL/L）下，Desmodesmus sp.WC08的油脂含量最高，较易积累油脂。在高磷浓度（1.2 mmoL/L）下的油脂含量较低，磷浓度为0.3～0.8 mmoL/L时，油脂含量无显著差异。同时，随磷浓度升高，油脂产量先升高再逐渐降低，磷浓度为0.5 mmoL/L时，油脂产量最高，其次为0.3和0.1 mmoL/L，三者无显著差异，磷浓度为1.2 mmoL/L时，油脂产量最低，约为0.5 mmoL/L组油脂产量的一半。

图6　磷浓度对Desmodesmus sp.WC08油脂积累的影响Fig.6　Effects of phosphorus concentrations on the lipid accumulation of microalagae Desmodesmus sp.WC08

2.4Desmodesmus sp.WC08对培养基中的氮、磷的吸收利用

从图7可以看出，5 mmol/L组和10 mmol/L组的氮源分别在第8 d和第12 d被消耗完，15、20和30 mmol/L组对氮源的利用率较低，在18 d时的利用率分别是68.82%、58.84%和39.65%。随着氮浓度的增加氮的利用率逐渐降低，可能是Desmodesmus sp.WC08对氮的吸收存在饱和状态，过高的氮浓度反而会抑制Desmodesmus sp.WC08的生长和油脂积累［2］。图8所示，磷浓度为0.1、0.3和0.5 mmol/L组磷源分别在4、6和10 d被完全吸收，0.8和1.2 mmol/L组磷源在18 d基本吸收完全。对比氮、磷消耗曲线可以发现，磷浓度为0.1和0.3 mmol/L组的磷源分别在4和6 d被完全吸收，而对氮的吸收还在继续，说明Desmodesmus sp. WC08在一定磷浓度下，对氮的吸收影响较小。对比不同氮浓度的生长曲线和氮消耗曲线可知，当氮浓度为10 mmol/L时生物量和油脂产量均最大，且此时氮消耗完全，而氮浓度在15 mmol/L是生物量和油脂产量均降低，因此氮浓度在10～15 mmol/L范围内继续增加可能会促进Desmodesmus sp.WC08的生长和油脂的积累。当氮浓度为10 mmol/L时，在12 d时培养基中氮消耗完全，但对比生长曲线发现藻细胞仍在增长，说明在缺氮条件时，藻细胞能够利用自身所储备的氮源，这与张森等［17］的研究结果一致。

图7　不同氮浓度下氮的消耗曲线Fig.7　Consumption curves of nitrogen under different nitrogen concentrations

图8　不同磷浓度下磷的消耗曲线Fig.8　Consumption curves of phosphorus under different phosphorus concentrations

表3　Desmodesmus sp.WC08在不同磷浓度中的生物量Table 3　Biomass concentration of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different phosphorus concentrations

3　结论

本实验以BG11培养基为基础，考察了不同氮源、氮浓度及磷浓度对一株热带海洋富油微藻Desmodesmus sp.WC08生长和油脂积累的影响。实验结果表明，Desmodesmus sp.WC08在以氯化铵为氮源时无法正常生长，其他三种氮源（硝酸钠、亚硝酸钠和尿素）对Desmodesmus sp.WC08生长和油脂含量影响较小，但对油脂产量有显著影响。以有机氮源尿素为氮源时生物量和油脂产量最高。以尿素为氮源时，Desmodesmus sp.WC08生物量随氮浓度升高而升高，油脂含量逐渐降低。当氮浓度为10 mmol/L时，油脂产量最高。低氮浓度有助于Desmodesmus sp. WC08细胞内油脂积累，而高氮浓度既不利于生长也不利于油脂积累。随磷浓度的升高，Desmodesmus sp. WC08的生长和油脂积累先增加后减少，当磷浓度为5 mmol/L时生物量和油脂积累均达到最大。综上，四种氮源中，最适合Desmodesmus sp.WC08生长和油脂积累的氮源为尿素且最适浓度为10 mmol/L，最适磷浓度为0.5 mmol/L。

［1］Amaro H M，Guedes A C，Malcata F X.Advances and perspectives in using microalgae to produce biodiesel［J］.Applied Energy，2011，88（10）：3402-3410.

［2］Li X，Hu H Y，Zhang Y P.Growth and lipid accumulation properties of a freshwater microalga Scenedesmus sp.Under differentcultivationtemperature［J］.BioresourceTechnology，2011，102（3）：3098－3102.

［3］Rawat I，Kumar R R，Mutanda T，et al.Biodiesel from microalgae：acritical evaluation from laboratory to large scale production［J］.Applied Energ，2013，103：444-467.

［4］Tabernero A，Mardín del Valle E M，Galán M A.Evaluating the industrial potential of biodiesel from a microalgae heterotrophic culture：scale-up and economics［J］.Biochemical Engineering Journal，2012，63：104-115.

［5］Imran P，Kaumeel C，Basil G，et al.Nitrogen stress triggered biochemicalandmorphologicalchangesinthemicroalgae Scenedesmus sp.CCNM 1077［J］.Bioresource Technology，2014，156：146-154.

［6］Luveshan R，Abhishek G，Ismail R，et al.The optimization of biomass and lipid yields of Chlorella sorokiniana when using wastewater supplemented with different nitrogen sources［J］. Bioresource Technology，2014，168：127-135.

［7］Vineela C，Larelle F，Sasi N.Biomass，lipid productivity and fatty acid composition of fresh water microalga Rhopalosolen saccatus cultivated under phosphorous limited conditions［J］. Algal Research，2015（8）：69-75.

［8］江怀真，张维，刘天中，等.氮、磷浓度对小球藻生长及油脂积累的影响［J］.食品工业科技，2011（6）：204-207，211.

［9］季方，郝睿，刘颖，等.一株高生物量链带藻分离筛选与培养条件优化［J］.农业机械学报，2013，S2：149-154.

［10］张森，刘平怀，王影，等.铁、镁及钙对微藻Desmodesmus sp.WC08生长和油脂积累的影响［J］.广东农业科学，2014（4）：126-130.

［11］李刚.厌氧发酵液培养链带藻高生物量累积及热裂解产物研究［D］.北京：中国农业大学，2014.

［12］刘平怀，张森，杨勋，等.氮、磷源及海盐对微茫藻细胞生长和油脂积累的影响［J］.食品工业科技，2013，34（7）：186-189.

［13］Dortch Q，Clayton J J R，Thoresen S S.Species differences in accumulation of nitrogen pols in phytoplankton［J］.Marine Biology，1984，81：237-250.

［14］刘平怀，郝宗娣，杨勋，等.不同氮源对2种微藻生长及总脂含量的影响［J］.生态环境学报，2012，21（8）：1429-1433.

［15］Chittra Y S，Benjamas C.Effect of nitrogen，salt，and iron content in the growth medium and light intensity on lipid production by microalgae islated from freshwater sources in Thailand［J］.Bioresource Technology，2011，102：3034-3040.

［16］Feng P Z，Deng Z Y，Fan L，et al.Lipid accumulation and growth characteristics of Chlorella zofingiensis under different nitrate and phosphate concentrations［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，114（4）：405-410.

［17］张森，刘平怀，王丽波，等.氮对纤维藻生长、油脂积累及营养吸收的影响［J］.食品工业科技，2014，35（01）：155-159.（3）：349-361.

Effects of nitrogen and phosphorus on cell growth and lipid accumulation of tropic ocean microalgae strain Desmodesmus sp.WC08

LUO Ning，ZHANG Sen，LIU Ping-huai*
（Key Study Center of the National Ministry of Education for Tropical Resources Utilization/Hainan Provincial Key Lab of Fine Chem，Hainan University，Haikou 570228，China）

In order to study the effects of nitrogen sources and the concentrations of nitrogen and phosphorus on the growth，lipid accumulation of a marine algae Desmodesmus sp.WC08.Four nitrogen sources such as sodium nitrite，sodium nitrate，urea and ammonium chloride and different concentrations of urea and phosphorus were investigated based on the BG11 media.The results showed that different nitrogen sources made little difference to Desmodesmus sp.WC08 except for ammonium chloride.In addition，the growth and lipid accumulation proved to be best when using urea as nitrogen source.Accordingly，the best growth and lipid accumulation which would be easily affected if the concentration of nitrogen was higher or lower，could be obtained at the optimal concentration of nitrogen（10 mmol/L）.Likewise，the growth and lipid accumulation could be obtained at the optimal concentration of phosphorus（0.5 mmol/L）.To be concluded，the nitrogen and phosphorus could be thoroughly absorbed by WC08 and the nutrients in the BG11 media could also be fully used at the their optimal concentrations.

Desmodesmus sp.WC08；nitrogen sources；nitrogen concentrations；phosphorus concentrations；nutrient uptake

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0223-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.036

2015－07－21

罗宁（1991-），男，硕士研究生，主要从事微藻培养及其生物活性物质方面的研究，E-mail：luoning0615@sina.cn。

刘平怀（1967-），男，硕士，教授，主要从事微藻生物质资源方面的研究，E-mail：twlph@163.com。

国家科技支撑计划项目课题（2011BAD14B01）；海南省中药现代化科技专项（ZY201327）；国家科技型中小企业技术创新基金（13C26244604892）；海南省产学一体化项目（CXY20150034）。