水解度对螺旋藻肽乳化性、起泡性及抗氧化性的影响

马艳芳，李玉洋，刘金龙，郑明刚，孙中涛，*（.山东农业大学生命科学学院，山东泰安708；.国家海洋局海洋生物活性物质与现代分析技术重点实验室，山东青岛66000）

水解度对螺旋藻肽乳化性、起泡性及抗氧化性的影响

马艳芳1，李玉洋1，刘金龙1，郑明刚2，孙中涛1，*
（1.山东农业大学生命科学学院，山东泰安271018；2.国家海洋局海洋生物活性物质与现代分析技术重点实验室，山东青岛266000）

研究了水解度对螺旋藻肽乳化性、起泡性以及抗氧化能力的影响。结果表明，随着水解时间的延长，螺旋藻肽的水解度逐渐增大。水解过程中，螺旋藻肽的起泡性、DPPH自由基清除能力以及还原力均随着水解度的增加先增大后减小，羟基自由基清除能力随着水解的进行先减小后增大，达到最大后再减小。而泡沫稳定性、乳化性、乳化稳定性则随着水解度的增大逐渐减小。这说明，在螺旋藻肽的生产过程中，并不是水解度越大越好，而应根据对产品物化性质与抗氧化能力的要求，确认最佳水解度。

螺旋藻肽，水解度，乳化性，起泡性，抗氧化性

螺旋藻（Spirulina platensis Geitl）是一类由单细胞或多细胞组成的丝状低等原核生物。螺旋藻富含藻胆蛋白，其含量可达细胞干重的10%～24.8%［1］。藻胆蛋白是一类存在于某些藻类藻胆体中的色素复合蛋白，其氨基酸组成比例非常理想，其中8种必需氨基酸的含量接近或者超过FAO推荐的标准［2］。螺旋藻是一种应用广泛的功能性食品原料，具有减轻癌症放疗、化疗的毒副反应，提高免疫功能，降低血脂等多种功效［3-4］。目前，螺旋藻多以干粉的形式直接应用于食品行业，但是由于其溶解性差、腥味浓重的缺点，使其应用受到一定的限制。

采用蛋白酶对藻胆蛋白进行水解，可以改善其物化特性，扩大应用范围。与藻胆蛋白相比，其水解产物螺旋藻肽不仅具有较低的分子量和良好的物化特性，更容易被人体消化吸收，而且还具有提高人体免疫功能，消除并防止机体受到自由基破坏，全面调节人体代谢机能等生理作用，其中以其抗氧化能力最受关注［5］。

螺旋藻肽的物化特性和抗氧化能力与水解度有关，目前对螺旋藻多肽生产工艺的优化也多以提高水解度为目标。但水解度与螺旋藻肽的起泡性、乳化性、抗氧化能力之间并不是单纯的线性关系，螺旋藻肽生产过程中单纯追求高水解度并不科学，而应控制一个合适的水解度，使产品具有更高抗氧化能力与更好的物化特性。

本文以螺旋藻干粉为原料制备不同水解度的螺旋藻肽，并对其起泡性、乳化性与抗氧化能力进行测定，以探明水解度对起泡性、乳化性与抗氧化能力的影响，为螺旋藻肽生产中最佳水解度的控制提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

螺旋藻粉（100 g）山东省滨州天健生物科技有限公司，蛋白质质量分数为59.875%；碱性蛋白酶（2×105U/mL） 南宁东恒华道生物科教有限责任公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH） Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

JA1003电子天平上海恒平科技仪器有限公司；pHS-3C型数字酸度计上海雷磁仪器厂；79-1磁力搅拌器国华电器有限公司；THZ-C恒温振荡器太仓市实验设备厂；TGL-16B小型台式离心机上海安亭科学仪器厂；UV2800型紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司；QL-901振荡器海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电子调温万用电炉龙口市电炉制造厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵巩义市予华仪器有限责任公司；R-501旋转蒸发器上海一科仪器有限公司；JT-8000Y喷雾干燥机常州博锐特干燥设备有限公司。

1.2样品制备

参考刘士伟等［6］的方法并稍有改动：采用纯净水将螺旋藻粉配制成10%的悬浮液，调pH8.0，加入碱性蛋白酶，加酶量4300 U/g螺旋藻，于55℃水解240 min，每40 min取样一次并测定水解度。水解完成后，加热至85℃保温20 min进行灭酶，然后5000 r/min离心15 min，收集上清液，采用真空旋转蒸发器浓缩后，再于进口温度200℃、出口温度70℃的条件下进行喷雾干燥获得螺旋藻肽干粉。

1.3水解度的测定

水解度（degree of hydrolysis，DH）可用水解后生成的ɑ-氨基氮的量占总含氮量的百分比表示［7］。如下式：

水解度（%）=水解后生成的α-氨基态氮的量/样品的总含氮量×100

水解后生成α-氨基态氮的量可用茚三酮法测定，样品总含氮量用凯氏定氮法（参照国标GB/T 23530-2009）进行测定。

1.4乳化性的测定

参考Klompong［8］的测定方法，并稍有改动，配制1%的上述螺旋藻肽干粉溶液，用移液管取30 mL与10 mL植物油混匀，并调节pH分别为3、5、6、7、9，然后乳化1 min，制成乳化液，分别在0 min和10 min时用微量移液器吸取底部的乳状液100 μL，加入10 mL 0.1%的SDS溶液并混匀，以0.1%的SDS作空白对照，测定其在500 nm处的吸光度A0和A10。A0即为乳化性（EA），乳化稳定性（ES）用下式计算：

1.5起泡性及其稳定性的测定

参考刘红梅等［9］的方法，准确称取经喷雾干燥得到的螺旋藻肽干粉0.1 g，溶解于2 mL去离子水中，用玻璃棒搅拌均匀，静置10 min后，倒入10 mL量筒中，用力上下振荡1 min，快速记录此时泡沫体积并记为H0，静置10 min后，记录下此时泡沫体积H1。H0用来评价样品的起泡能力，H1/H0来表示样品泡沫体积的稳定性。

1.6抗氧化能力的测定

1.6.1DPPH自由基清除能力采用Yama［10］的方法并稍有改动：取2 mL一定浓度（0.5～2.5 mg/mL）的螺旋藻肽溶液添加至2 mL 0.2 mmol/L的DPPH的95%乙醇溶液中，混合振荡后，在室温下放置30 min，于517 nm处测定吸光值。清除DPPH自由基的能力为SA。

式中，空白对照—95%乙醇+蒸馏水；A1—DPPH溶液+螺旋藻肽溶液测得的吸光值；A2—95%乙醇+螺旋藻肽溶液测得的吸光值；A3—DPPH溶液+蒸馏水测得的吸光值。

1.6.2羟基自由基清除能力参考吴琼英［11］的方法：取一定浓度的样品2 mL（0.5～2.0 mg/mL），依次加入2 mL硫酸亚铁（6 mmol/L），2 mL H2O2（6 mmol/L），混合静置10 min，再加入2 mL水杨酸（6 mmol/L）混匀，静置30 min后，在510 nm处测吸光值为Ai，当用双蒸水代替水杨酸时测得的吸光值为Aj，空白对照组以双蒸水代替样品测得的吸光值为A0，则酶解物对羟基自由基的清除率（%）表示为：

1.6.3还原力采用Osawa［12］的方法：取一定浓度的样品1 mL（0.5～2.5 mg/mL），加入0.1 mol/L的磷酸缓冲液2.5 mL和1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，充分混合以后，在50℃下保温20 min，随后加入10%的三氯乙酸2.5 mL，经充分混合后，以3000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸馏水2.5 mL以及0.1%FeCl32.5 mL，然后在700 nm波长处进行比色，吸光度越大说明还原力越强，空白对照以蒸馏水代替离心后的上清液。

1.7数据处理

所有数据采用WPS Office 2015、Origin 75软件分析。

2　结果与分析

2.1酶解时间对水解度的影响

螺旋藻蛋白酶解过程中水解度随时间的变化规律如图1所示。由图1可知随着水解时间的延长，螺旋藻肽的水解度逐渐增大，这与李雪等［13］用碱性蛋白酶水解草鱼鱼肉蛋白得到的规律相似。其主要原因是酶解初期酶与底物接触的机会大，反应速率快；随着时间的延长，底物浓度降低，酶活力也有一定的损失，导致水解反应速率降低。不同水解度的酶解产物可以通过控制酶解时间来获得，所制备的酶解时间分别40、80、160、240 min的螺旋藻肽样品，其水解度分别为6.80%、9.47%、12.57%、16.40%。

2.2水解度对螺旋藻肽乳化性的影响

图1　DH随时间的变化Fig.1　Effect of hydrolysis time on DH

水解度对螺旋藻肽乳化性（EA）和乳化稳定性（ES）的影响如图2所示。在pH3～9范围内，螺旋藻肽在低水解度时具有较好的乳化性和乳化稳定性，但随着螺旋藻粉水解度的增大，螺旋藻肽的乳化性与乳化稳定性均显著降低，这种规律同时存在于鲑鱼肌肉蛋白酶解物中［14］。其主要原因是蛋白质酶解为小分子肽后，溶液黏度与表面张力降低，不利于乳化性及乳化稳定性。此外，由图2还可以看出，在pH7，一定水解度时，螺旋藻肽的乳化性最小，乳化稳定性最强，这与螺旋藻肽的等电点在pH7附近有关，这种现象也见于燕麦胶酶解物［15］。

图2　水解度对螺旋藻肽乳化性及乳化稳定性的影响Fig.2　Effect of DH on emulsifying activity and emulsifying stability of Spirulina protein hydrolysates

2.3水解度对螺旋藻肽起泡性及泡沫稳定性的影响

水解度对螺旋藻肽起泡性（FC）及泡沫稳定性（FS）的影响如图3所示。提高螺旋藻的水解度，螺旋藻肽起泡性增大，并在水解度为12.57%时达到最大值，此后，再提高水解度，螺旋藻肽的起泡性反而降低；由图2可以发现泡沫稳定性随着螺旋藻水解度的提高一直在降低。这与大豆肽溶液的起泡性与泡沫稳定性随水解度变化的规律类似［16］。其原因是随着水解度的提高，螺旋藻肽的分子量降低，溶液的黏度与表面张力发生变化，从而影响其起泡性与泡沫稳定性。

图3　水解度对螺旋藻肽起泡性及泡沫稳定性的影响Fig.3　Effect of DH on foaming activity and foaming stability of Spirulina protein hydrolysates

2.4抗氧化能力的测定

图4　水解度对螺旋藻肽DPPH自由基清除能力的影响Fig.4　Effect of DH on DPPH radical scavenging ability of Spirulina protein hydrolysates

2.4.1水解度对螺旋藻肽DPPH自由基清除能力的影响DPPH自由基清除能力是表征天然抗氧化剂体外抗氧化活性的重要指标，在517 nm处有最大吸光度，其颜色变化及在517 nm的吸光度与抗氧化剂的自由基清除能力存在线性关系。水解度对螺旋藻肽DPPH自由基清除能力的影响如图4所示，增大螺旋藻粉的水解度，可以提高螺旋藻肽的DPPH自由基清除能力，并在水解度为12.57%时达到最大；但水解度过高时，DPPH自由基清除能力反而下降。这与付中民等报道的蜂王浆蛋白酶解物对DPPH自由基清除能力的规律类似，但蜂王浆蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力在水解度为4.18%时最大［17］。

2.4.2水解度对螺旋藻肽羟基自由基清除能力的影响羟基自由基是目前已知的活性最强的活性氧自由基，可与DNA、蛋白质等生物分子发生反应，造成细胞损伤。水解度对螺旋藻肽羟基自由基清除能力的影响如图5所示，螺旋藻肽的羟基自由基清除能力随水解度的增大先减小、后增大，并在水解度为12.57%时达到最大，此后，再增大水解度，其羟基自由基的清除能力反而明显下降。这与You等报道的泥鳅蛋白水解物的羟基自由基清除能力随水解度的变化规律是一致的，但泥鳅蛋白水解物的羟基自由基清除能力在水解度为23%时最大［18］。

图5　水解度对螺旋藻肽羟基自由基清除能力的影响Fig.5　Effect of DH on hydroxyl radical scavenging ability of Spirulina protein hydrolysates

图6　水解度对螺旋藻肽还原力的影响Fig.6　Effect of DH on reducing power of Spirulina protein hydrolysates

2.4.3水解度对螺旋藻肽还原力的影响还原力是指抗氧化剂提供电子的能力，是评价抗氧化剂体外抗氧化能力的一个重要指标。水解度对螺旋藻肽还原力的影响如图6所示，当螺旋藻粉的水解度较低时，螺旋藻肽的还原力随着水解度的增大可显著提高，并在水解度为12.57%时达到最大，此后，再提高水解度，还原力反而下降。这与Rossawan等报道的鲣鱼鱼籽酶解物的还原力与水解度的关系具有相同的规律，即还原力先随着水解度的增大而增大，达到最大值后，再提高水解度，还原力反而降低，但鲣鱼鱼籽酶解物的还原力是在水解度为5%时最大［19］，这说明生产抗氧化性肽时，应根据蛋白质原料的种类，控制不同的水解度，以获得最大还原力。

3　结论

水解度对螺旋藻肽的乳化性、起泡性以及抗氧化能力有重要影响。水解度较小时，螺旋藻肽具有较强的乳化性与乳化稳定性，但随着水解度的增大，其乳化性和乳化稳定性均逐渐降低。增大水解度可以改善螺旋藻肽的起泡性，水解度为12.57%时起泡性最大，水解度过高，起泡性反而降低，但泡沫稳定性与起泡性的变化规律不同，它随着水解度的增大逐渐减小。增大水解度可提高螺旋藻肽的抗氧化能力，水解度为12.57%时，其DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力与还原力最大，水解度过高时，抗氧化能力反而下降。目前，国内外对螺旋藻粉酶解工艺的研究多以提高水解度为目标，但是并未充分考虑水解度对螺旋藻肽物化性质与抗氧化能力等生理活性的影响，这样是不科学的。因此在水解过程中，应根据生产目的控制一个最佳水解度，并不是水解度越高越好。本研究初步研究了水解度对螺旋藻肽物化性质及抗氧化能力的影响，但是并没有对如何根据产品要求准确控制水解度进行研究，后续实验可以对此进行进一步的研究。

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Effect of degree of hydrolysis on emulsification，foaming capacity and antioxidant activity of Spirulina peptides

MA Yan-fang1，LI Yu-yang1，LIU Jin-long1，ZHENG Ming-gang2，SUN Zhong-tao1，*
（1.College of Life Science，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China；2.Key Lab of Marine Bioactive Substance and Modern Analytical Technique，Qingdao 266000，China）

The effect of the degree of hydrolysis（DH）on the emulsification，foaming capacity and antioxidant activity of Spirulina peptides was investigated.The DH of the hydrolysate increased during the process of hydrolysis.In the process of hydrolysis，the foaming activity，DPPH radical scavenging ability，and reducing power of Spirulina peptides first increased then decreased with the increase of the DH，the hydroxyl radical scavenging ability first decreased then increased，when reached maximum then decreased，however the foaming stability，the emulsification，emulsifying stability decreased with the increase of the DH.This showed that the DH was not the higher the better in the production of Spirulina peptides，and the best DH must be determined according to the need of the products to get a better physicochemical properties and antioxidant abilities.

Spirulina peptide；degree of hydrolysis；emulsifying activity；foaming activity；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.031

2015－08－03

马艳芳（1989-），女，硕士研究生，研究方向：发酵工程与酶工程，E-mail：ffang0625@126.com。

孙中涛（1973-），男，博士，副教授，研究方向：发酵工程与酶工程，E-mail：zhtsun@sdau.edu.cn。

国家海洋局海洋生物活性物质与现代分析技术重点实验室开放基金资助（MBSMAT-2014-05）。