河蚬肉抗氧化肽的分离及活性研究

刘晶晶，汤会芳，郭芝琳，韩曜平，王雪锋，戴阳军（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

河蚬肉抗氧化肽的分离及活性研究

刘晶晶，汤会芳，郭芝琳，韩曜平，王雪锋，戴阳军
（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

目的：为制备具有抗氧化活性的河蚬肉抗氧化肽。方法：河蚬肉酶解液经膜分离后，采用Sephacryl S-100 HR凝胶层析柱进行分离，得到抗氧化性最强的组分经CM Sepharose FF离子交换层析柱进一步分离，并对各组分的体外抗氧化活性进行测定。结果：经Sephacryl S-100 HR凝胶层析柱分离得到5个活性组分A、B、C、D和E，其中组分C的抗氧化活性较强，其总抗氧化能力A700 nm、羟自由基清除率和DPPH自由基清除率分别为1.79、83.33%和26.35%。组分C经CM Sepharose FF离子交换层析柱进一步分离得到2个活性组分C1和C2，其中C2的抗氧化活性最强，总抗氧化能力A700 nm、羟自由基清除率和DPPH自由基清除率分别为2.03、92.34%和35.94%。结论：河蚬酶解液抗氧化肽的羟自由基清除能力突出，该研究为河蚬肉抗氧化肽的开发提供理论技术依据。

河蚬肉，抗氧化肽，分离

目前，食品行业由于利益驱使，普遍使用化学合成的抗氧化剂，其本身具有毒副作用，因此，天然抗氧化剂的研究受到越来越多的关注。世界各国科学家开发出的各种天然抗氧化剂产品，受到了人们的广泛欢迎。近年来，从水产蛋白中提取抗氧化活性肽的研究也逐渐展开，如已从鳞鱼、鲭鱼、巨鱿鱼皮、白虾头和黄鳍金枪鱼骨架蛋白中提取出具有显著抗氧化活性的肽段［1］，这充分证明水产品中的优质蛋白具有制备抗氧化肽的潜力。

河蚬，学名（Corbicula fluminea），又称黄蚬、金蚶、扁螺等，是双壳类软体动物，是我国重要的经济贝类之一。它们生长速度快、繁殖能力强，养殖方法简单，资源极为丰富［2］。河蚬肉蛋白酶解物中含有大量短肽、多肽及氨基酸等营养成分，并产生了一些具有特殊生理功能的生物活性肽，具有广泛应用前景。邱春江等［3］利用木瓜蛋白酶水解花蚬蛋白，得到的酶解物具有很强的清除羟自由基能力。刘杰等［4］研究了河蚬酶解液具有显著的清除超氧阴离子自由基和羟自由基作用。张磊等［5］探讨了河蚬提取物可能通过抑制脂质过氧化反应对酒精性肝损伤有保护作用。吴立峰等［6］报道河蚬糖蛋白对小鼠化学性肝损伤有保护作用。王一铮等［7］研究了河蚬汤对小鼠急性乙醇肝损伤的保护作用。JS Tsai等［8］研究了河蚬肌肉蛋白水解物对血管紧张素Ⅰ转换酶具有一定的抑制作用。而目前国内外对河蚬抗氧化肽的分离未见报道，本论文通过对河蚬肉酶解液中抗氧化肽进行分离，并对其抗氧化活性进行分析，为河蚬天然抗氧化肽的开发提供理论依据，从而提高河蚬深加工产品的品质和附加值。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

速冻河蚬肉江苏省宿迁楠景水产品有限公司；中性蛋白酶（60000 U/g） 上海奥宇生物科技有限司公司；氢氧化钠、盐酸、DPPH、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、Tris（三羟基氨基甲烷）、氢氧化钠、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁、铁氰化钾、乙醇、乙酸、过氧化氢、邻氮二菲、氯化钠以上试剂均为分析纯。

EL104电子天平梅特勒—托利多仪器有限公司；BCD-216TDXZA超低温冰箱青岛海尔股份有限公司；BSZ-30自动部分收集器、DHL-B电脑数显定式恒流泵上海沪西分析仪器厂；高速组织捣碎机上海比朗仪器制造有限公司；HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司；pHS-2F型数字pH计、UV-754紫外分光光度计上海精密科学仪器有限公司；ALPHA1-4冷冻干燥机德国MARTIN CHRIST公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；AKTA自动快速蛋白纯化系统、HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR凝胶层析柱（Φ5.0 cm×100 cm）、CM Sephrose FF离子交换层析柱（Φ26 cm×30 cm） 美国GE公司。

1.2实验方法

1.2.1河蚬肉酶解液的制备按照参考文献［9］制备河蚬酶解液。

1.2.1.1工艺流程新鲜河蚬肉→流水解冻→匀浆→调节pH→加入中性蛋白酶→酶解→灭酶→冷却→4000 r/min离心20 min→上清液→滤膜超滤→滤过液（河蚬肉酶解液）→冷冻干燥→粗肽。

1.2.1.2操作要点河蚬肉预处理：将新鲜河蚬肉常温流水解冻，在低温条件下，按1∶2（g/mL）的料液比加水后用组织捣碎机匀浆，即可得到河蚬肉匀浆液。

河蚬肉酶解工艺：取一定量的河蚬肉匀浆液，调节pH至6.0，按照0.94%（以河蚬肉计）的比例添加中性蛋白酶，在55.36℃酶解4 h，酶解完成，100℃下灭酶20 min，低温条件（10℃）下4000 r/min离心20 min，取出上清液，经5000 u滤膜超滤后，即可获得河蚬肉酶解液。

酶解液冷冻干燥：将河蚬肉酶解液真空冷冻干燥10 h，即可得到河蚬肉酶解液粉末，冷藏备用。

1.2.2河蚬肉酶解液中抗氧化肽的分离纯化参照参考文献［10-12］分离河蚬酶解液的抗氧化肽。

取河蚬肉酶解液冷冻干燥粉末，配制成质量分数为50 mg/mL的溶液，通过高速冷冻离心机在低温下离心30 min，取上清液，经滤膜过滤后，利用Sephacryl S-100 HR凝胶层析柱对该溶液进行分离纯化。上样量为2 mL，以蒸馏水为洗脱液，通过自动部分收集器分管收集，流速为0.5 mL/min，每5 min收集一管，在检测波长为280 nm处测定收集洗脱液的吸光值，合并同一分离峰的洗脱液，将合并的洗脱液冷冻干燥制成粉末，冷藏待用。

将Sephacryl S-100 HR凝胶层析柱分离得到的抗氧化性较强组分C配制成50 mg/mL的溶液经CM Sephrose FF离子交换层析柱进一步分离纯化。上样量为0.5 mL，用1 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为0.5 mL/min，每5 min收集一管，通过自动收集器分管收集活性成分。在检测波长为280 nm处测定收集洗脱液的吸光值，合并同一分离峰的洗脱液，将合并的洗脱液冷冻干燥制成粉末，冷藏待用。

1.2.3各组分抗氧化活性的测定称取一定量经Sephacryl S-100 HR凝胶层析柱分离得到的五个组分A、B、C、D、E和经CM Sepharose FF离子交换层析柱进一步分离得到的两个组分C1和C2的冻干粉，配制成0.5 mg/mL的溶液。根据刘杰［13］、吴燕燕等［14］的方法对其总抗氧化性、羟自由基的清除率和DPPH自由基清除能力进行测定。

1.2.3.1总抗氧化性的测定（三价铁离子还原力） 取1 mL样品，加入0.2 mol/L的pH6.6的PBS溶液1 mL，加入1 mL质量分数为1%的铁氰化钾溶液，混合物置于50℃水浴中保温20 min，再添加质量分数为10%的三氯乙酸溶液1 mL，充分混合后1000 r/min离心4 min。取1 mL上清液，加入1 mL去离子水和0.1%质量分数的三氯化铁溶液0.2 mL，振荡混匀后在50℃下保温10 min。在700 nm波长处测定其吸光度值，以去离子水代替样品作为空白。

1.2.3.2羟自由基的清除率的测定取0.75 mmol/L邻二氮菲溶液0.5 mL，加入0.2 mol/L的PBS（pH7.4）1.0 mL，充分混匀，加入0.5 mL样品溶液以及0.75 mmol/L的硫酸亚铁0.4 mL，充分混匀，加入0.5 mL体积分数为0.01%的双氧水，混匀后，37℃水浴1 h，测定样品液在波长536 nm处的吸光度A样品。按照上述操作，采用去离子水代替样品测定损伤管吸光度A损，采用去离子水代替样品液和双氧水测得未损伤管吸光度A未损。等体积的样品PBS和去离子水在536 nm处的吸光值为A参。等体积的去离子水和PBS在536 nm出的吸光值为A空。羟自由基清除率计算公式为：

1.2.3.3DPPH自由基清除能力测定取1.0 mL的样品，加入2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液1.0 mL，混匀后在室温下避光反应20 min，1000 r/min低温离心10 min，在517 nm波长下测吸光值Ai。空白组为0.5 mL无水乙醇代替DPPH乙醇溶液，加入0.5 mL去离子水，测定其在517 nm处的吸光值Aj。对照组为0.5 mL DPPH乙醇溶液，加入0.5 mL的去离子水代替样品，在517 nm处测定其吸光值A0。DPPH自由基清除率按以下公式计算：

2　结果与分析

2.1河蚬肉酶解液中抗氧化肽的分离纯化

图1　河蚬肉酶解液经Sephacryl S-100 HR凝胶层析柱洗脱曲线Fig.1　Elution profile of enzymatic hydrolysates of Corbicula flumineaon by Sephacryl S-100 HR

图1为河蚬肉酶解液经丙烯葡萄糖凝胶Sephacryl S-100的洗脱曲线。丙烯葡萄糖凝胶层析，是将样品经过丙烯葡萄糖凝胶层析柱，以丙烯葡萄糖凝胶作为固定相，选择合适的液体作为流动相，样品随着流动相移动，不同分子量的样品由于受到凝胶的阻力不同，随流动相流出层析柱所需的时间也会不同，由此就可以达到分离目的。由图1可知，河蚬肉酶解液经Sephacryl S-100分离，共得到五个清晰的洗脱峰，按出峰顺序，分别命名为A、B、C、D和E。对每一个分离峰进行收集。

图2　组分C经CM Sepharose FF离子交换层析柱洗脱曲线Fig.2　Elution profile of component C by CM Sepharose FF ion-exchange chromatography

图2为组分C经CM Sepharose FF离子交换层析柱的洗脱曲线。CM Sepharose FF离子交换层析柱是通过利用离子交换剂与原样之间电荷相反的性质，从而使原样中带某种电荷的分子被分离基质所吸附，然后用梯度的盐浓度将样品从离子交换层析柱中洗脱下来，从而达到对样品进行分离纯化的目的。由图2可知，组分C经CM Sepharose FF离子交换层析柱分离，共得到两个清晰的峰，记为C1和C2，合并同一分离峰的洗脱液。

2.2各组分的抗氧化活性分析

2.2.1总抗氧化活性分析图3为各组分的总抗氧化活性的测定结果，由图3可知，河蚬肉酶解液经丙烯葡萄糖凝胶Sephacryl S-100分离后得到的五个组分A、B、C、D和E都表现出抗氧化活性，在700 nm处的吸光值分别为0.45、1.32、1.79、0.82和0.51，组分B 和C的总抗氧化性能明显高于A、D、E三个组分；组分C经CM Sepharose FF离子交换层析柱后得到的C1 和C2在700 nm处的吸光值分别为0.98和2.03，且组分C和C1、C2之间的抗氧化活性都存在显著性差异（p＜0.05）。

图3　各分离组分总抗氧化活性比较Fig.3　Comparation the antioxidant activity between different fractions

2.2.2羟自由基清除能力的分析图4为各组分的羟自由基清除能力结果，由图4可知，组分C2清除羟自由基的活性最强，高达92.34%；其次为组分C和C1，羟自由基清除率分别为83.33%和74.51%；组分A、B、D和E羟自由基清除率分别为68.71%、67.22%、19.44% 和23.89%。

图4　各分离组分羟自由基清除能力比较Fig.4　The hydroxyl radicals scavenging activity of different fractions

2.2.3清除DPPH自由基能力的分析图5为河蚬肉酶解液分离各组分的DPPH自由基清除能力结果，由图5可知，C2组分清除DPPH的能力最强，高达35.94%；其次为B、C和C1，DPPH自由基清除能力分别为27.15%、26.35%和28.65%，且三者之间没有显著性差异（p＞0.05）；组分A、D和E清除DPPH自由基清除率也没有显著性差异（p＞0.05），分别为23.04%、21.43%和20.63%。

图5　各分离组分DPPH自由基清除能力比较Fig.5　DPPH radical scavenging abilities of different fractions

3　结论

河蚬肉酶解液经膜分离后，采用Sephacryl S-100 HR凝胶层析柱和CM Sepharose FF离子交换层析柱进行分离，得到7个不同组分，即A、B、C、D、E、C1和C2，其中C2的抗氧化活性最强，总抗氧化能力A700 nm、羟自由基清除率和DPPH自由基清除率分别为2.03、92.34%和35.94%。由此可见，河蚬酶解液抗氧化肽的羟自由基清除能力突出，为开发河蚬天然抗氧化产品提供了很好的依据。

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Separation and activity assay of antioxidant peptides from Corbicula fluminea meat

LIU Jing-jing，TANG Hui-fang，GUO Zhi-ling，HAN Yao-ping，WANG Xue-feng，DAI Yang-jun
（Department of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，China）

Objective：In order to separate the antioxidant peptides from Corbicula fluminea meat.Methods：In this experiment，enzymatic hydrolysates of Corbicula fluminea meat were isolated by Sephacryl S-100 HR gel chromatography after membrane separation，the oxidation resistance of the strongest components was further purified by CM Sepharose FF ion exchange chromatography and antioxidant activity in vitro of each group was measured.Results：The result showed that the enzymatic hydrolysates of Corbicula fluminea meat was fractionated into five active fractions by ephacryl S-100 HR gel chromatography，named as A，B，C，D and E. Among these，the fraction C showed the higher antioxidant activity，the total antioxidant capacity，scavenging ability of hydroxyl and DPPH radical were 1.79，83.33%，26.35%，respectively.Component C was further separated into two active components by CM Sepharose FF ion exchange chromatography，named as C1 and C2，the fraction C2 showed the highest antioxidant activity，the total antioxidant capacity，scavenging ability of hydroxyl and DPPH radical were 2.03，92.34%，35.94%，respectively.Conclusions：The radical scavenging ability of Corbicula fluminea meat was outstanding，which provides a theoretical basis for the deep processing of the peptide.

Corbicula fluminea meat；antioxidant peptide；separation

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0169-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.025

2015－06－15

刘晶晶（1978-），女，硕士，副教授，研究方向：食品加工和天然产物活性物质的开发与利用，E-mail：ljj@cslg.edu.cn。

2013年度江苏省苏州市应用基础研究计划项目（SYN201303）。