人乳牙牙髓干细胞全蛋白质非胶分级分离电泳分析

胡　家， 李　蕾， 王劲松， 赵君朋*

(1首都医科大学医学实验与测试中心，北京　100069； 2首都医科大学基础医学院； *通讯作者，E-mail: jp75@mail.ccmu.edu.cn)



人乳牙牙髓干细胞全蛋白质非胶分级分离电泳分析

胡家1， 李蕾1， 王劲松2， 赵君朋1*

(1首都医科大学医学实验与测试中心，北京100069；2首都医科大学基础医学院；*通讯作者，E-mail: jp75@mail.ccmu.edu.cn)

目的对人乳牙牙髓干细胞全蛋白质进行非胶分级分离电泳，并用液质联用质谱分析所得蛋白质组分。方法对人乳牙牙髓干细胞进行裂解，将所得的细胞全蛋白质均分到12孔样品槽里进行非胶分级分离电泳，液相回收电泳后的12个组分，对各组分进行SDS-PAGE分离，并对各组分进行溶液酶切后再进行液质联用质谱分析。结果SDS-PAGE图谱显示人乳牙牙髓干细胞全蛋白质经非胶分级分离电泳分成了12个不同的蛋白质组分，液质联用对各组分进行分析均成功鉴定到一定数目蛋白质。结论非胶分级分离电泳能将复杂蛋白质样品进行预分离，液相回收分离后样品便于进行液质联用分析。

非胶分级分离电泳；细胞全蛋白质；液质联用质谱；蛋白质组

蛋白质是生命活动的执行者，因此研究蛋白质组才能真正认清各种生理现象的分子机制。质谱技术是蛋白质组学的常用方法之一，通过质谱鉴定能认识某一蛋白质组的各个蛋白质组成。在进行质谱分析之前一般会对样品进行适当分离，如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、双向电泳、液相分离、离子交换等，每种方法均有自身的优势及缺点，样品分离的质量直接关系质谱检测结果。

非胶分级分离电泳(OFFGEL electrophoresis，OGE)是在安捷伦公司生产的Agilent 3100 OFFGEL等电聚焦分级分离仪上进行，其原理是在固定pH梯度的干胶条上，根据蛋白质或多肽的等电点进行等电聚焦分离；且分离的蛋白质或多肽，最终以液相的形式加以回收。OGE对于复杂蛋白质样品的分辨率与传统的等电聚焦电泳(IEF)是一样的，所不同的是分离所得各组分能液相回收，这样便于后续的液质联用分析[1]，而不需要切胶、提取多肽等繁琐步骤。以往研究还发现，采用等电聚焦电泳比用阳离子交换结合反向色谱分离蛋白质样品具有更高的分辨率[2]，并且按照等电点分离样品之后能得出蛋白质的等电点信息，为后期的质谱鉴定结果提供验证数据。

细胞的总蛋白质组具有宽泛的丰度范围，而对于低丰度蛋白质的有效分离和鉴定一直是困扰人们的难题之一。本实验对人乳牙牙髓干细胞进行裂解，将所得的细胞全蛋白质进行非胶分级分离电泳，由此将复杂蛋白质样品按照等电点分成12份，液相回收后，对各组分进行SDS-PAGE分离，并对各组分进行溶液酶切后再进行液质联用分析。

1　材料和方法

1.1主要试剂及仪器

α-MEM、FBS、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素均为Invitrogen公司产品。固相pH梯度干胶条(IPG strip pH3-10L，13 cm)、IPG缓冲液(pH 3-10的线性胶条)、覆盖油、尿素及等电聚焦相关耗材均为Agilent公司产品，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、硫脲、SDS、甘氨酸、Tris、2D Quant蛋白定量试剂盒均为GE公司产品，胰蛋白酶为Promega公司产品，过硫酸铵、二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺、考马斯亮蓝G250、三氟乙酸、甲酸为Sigma公司产品，脱盐柱为Waters公司产品，乙腈为Fluka公司产品。等电聚焦仪OFFGEL(美国Agilent公司)；超速离心机(德国Heraeus公司)；Speed Vac真空干燥机(美国Thermo公司)；Easy-Nano LC液相色谱仪和Q-Exactive plus质谱仪(美国Thermo公司)；DU800分光光度计(德国Beckman公司)。

1.2人乳牙牙髓干细胞培养

参照文献[3，4]的方法，乳牙牙髓取自7-8岁儿童的滞留乳中切牙(n=3)，均为男性，经临床工作人员和患儿及其家长同意。将中段牙髓组织反复清洗，剪碎，置于含Ⅰ型胶原酶(3 g/L)和分散酶(4 g/L)的消化液中，37 ℃消化15 min，室温1 000 r/min离心5 min，去上清，加入细胞生长培养基(α-MEM加10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养，每2-3 d更换一次培养基。取3-5代细胞进行实验。

1.3人乳牙牙髓干细胞全蛋白质制备

[5]方法对人乳牙牙髓干细胞进行蛋白质裂解，裂解液含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、8 mol/L尿素、20 mmol/L DTT及蛋白酶抑制剂(Roche，1片/10 ml)。向细胞沉淀中加入5倍体积的裂解液，涡旋均匀，置于冰上裂解细胞2 h。裂解过程中将样品置于冰浴中超声破碎细胞，控制超声功率2 W，超声时间2 s，间歇2 s，超声至样品溶液澄清。将样品溶液进行高速离心，4 ℃，40 000×g离心1 h。离心结束后取上清，分装，保存于-80 ℃，同时取5 μl×3样品做蛋白定量用，采用GE公司2D Quant蛋白定量试剂盒对细胞全蛋白质进行蛋白质定量。

1.4细胞全蛋白质非胶分级分离电泳

细胞全蛋白质制备好后，即可进行非胶分级分离电泳。溶液配制：按照试剂盒(Agilent 3100 OFFGEL Fractionator Kit)说明配制1.25×储液。使用时用水稀释成1×工作液，再取200 μg细胞全蛋白质用1.25×储液稀释至2 ml。将聚焦槽放于非胶分级分离仪上，整个实验过程保持水平。撕开IPG胶条的保护膜，将有凝胶一面朝上放入聚焦槽，“+”极端顶住放置固定电极一端。在胶条上放入12孔样品槽，压平卡住。每个样品孔加入40 μl 1×工作液，让胶条水化15 min。取4块电极垫片放入1×工作液充分浸湿，紧贴样品槽的外侧两端各放上两片，保证垫片与凝胶之间无缝隙。上样：每个样品孔加入150 μl稀释过的蛋白质样品，盖上密封盖，压平盖紧。再取10 μl去离子水加在电极片上。最后加覆盖油：先取200 μl加在“+”极端，1 ml加在“-”极端，过1 min后，在两端各加入200 μl。聚焦完成后，分别取出12个样品孔里的样品，再每个组分取出10 μl，以及未分离细胞全蛋白质取5 μl进行SDS-PAGE分离，其余样品用于液质联用分析。

1.5蛋白质沉淀及酶切

将已分离的12个组分的蛋白质样品用10% TCA/丙酮进行沉淀[7]，冻干，参照文献[8，9]方法进行酶切。酶切反应过夜(16 h以上)进行，于次日用终浓度为0.1% TFA终止反应，然后用脱盐柱去除杂质，最后冻干所得多肽样品。

1.6液质联用质谱分析

将冻干的12个组分多肽样品重溶于0.1 %甲酸溶液，进行液相色谱-质谱联用(Easy-Nano LC，Q-Exactive plus，Thermo)分析。液相条件：反相色谱柱采用C18柱(10 cm×75 μm，3 μm)。流动相A液为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B液为含0.1%甲酸的乙腈溶液，流速为300 nl/min。质谱条件：纳升级电喷雾电离方式(Nano-ESI)，正离子模式扫描，碰撞能量为27%HCD，分辨率设置为一级70 000 m/z 200，二级17 500 m/z 200，母离子扫描范围为m/z 300-1 800，子离子扫描范围起始位m/z 100，数据依赖模式MS/MS，隔离窗口为1.6 D，动态排除为60 s；喷雾电压为2.0 kV，毛细管温度为275 ℃，S-lens：55%。质量数据由XCalibur软件采集处理。

1.7质谱数据的数据库搜索

采集的质谱数据用Proteome Discoverer1.4数据分析软件进行序列分析。酶解位点为精氨酸(R)，赖氨酸(K)，允许有两个漏切位点，允许一侧非特异性酶解。固定修饰：半胱氨酸的carbamidomethylation。可变修饰：Oxidation/+15.995 D(M)，Deamidated/+0.984 D(N，Q)。按肽段匹配假阳性率为1%输出搜库结果。

2　结果

2.1细胞全蛋白质非胶分级分离电泳后进行SDS-PAGE分离

将人乳牙牙髓干细胞全蛋白质经非胶分级分离电泳后，从“+”极到“-”极各组分样品依次标注为S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，S10，S11，S12。12组分的泳道中均有蛋白质条带(见图1)，且各泳道蛋白质条带有差异，相比较未进行OGE的细胞全蛋白质泳道(lysate)分离效果更好。

M.蛋白分子量标记；lysate为细胞全蛋白质；S1-S12分别表示经非胶分级分离电泳后所得的12个组分图1　细胞全蛋白质非胶分级分离电泳后SDS-PAGE图Figure 1　The map of SDS-PAGE of the total proteins isolated by OGE

2.2细胞全蛋白质非胶分级分离电泳所得12组分的质谱分析结果

将人乳牙牙髓干细胞全蛋白质非胶分级分离电泳所得的12个组分分别进行蛋白质沉淀、重溶后酶切、脱盐后，进行液质联用分析。图2所示为其中一个组分液相基峰离子流图(BPC)(A)、液相洗脱28.88 min时的一级质谱图(B)及m/z709.39的二级质谱图(C)。12个组分分别鉴定到的蛋白数见表1，从OGE时的“+”极到“-”极各组分样品依次标注为S1-P，S2-P，S3-P，S4-P，S5-P，S6-P，S7-P，S8-P，S9-P，S10-P，S11-P，S12-P。经质谱分析各组分，发现每一组分均鉴定到一定数目的蛋白质。

3　讨论

本实验对人乳牙牙髓干细胞全蛋白质进行OGE分离，收集分离出的12个组分，进行SDS-PAGE分离，结果显示分离效果良好，又将这12个分离所得组分酶切成多肽样品，去杂质后，再进行液质联用分析，共鉴定到1 798个非冗余蛋白质。非胶分级分离电泳技术对于复杂样品进行预分离，并且能液相回收各组分，再进行质谱分析。相比采用双向凝胶电泳技术对人乳牙牙髓干细胞全蛋白质进行分离[4]，省去了样品等电聚焦电泳之后向二相凝胶电泳转移的步骤，不仅操作流程更简单，耗时少，而且杜绝了转移过程中蛋白质丢失的可能。另外在质谱鉴定之前无需从凝胶中提取多肽，采用溶液酶切的方法能使更多多肽被质谱检测到。

本实验中，各组分质谱鉴定到的蛋白质数目可能受到去杂质及脱盐步骤的影响，而使得部分蛋白未被鉴定到。如图1、表1所示，其中S1，S2泳道的蛋白质条带相对较少，在质谱鉴定相应组分的结果中S1-P，S2-P的蛋白质数目相对其他各组分也少一些，而S2泳道比S1泳道的蛋白质条带明显，但其质谱鉴定的蛋白质数目并不相符。因此还需对去杂质脱盐步骤进行优化。

OGE适用于多种来源的复杂蛋白质样品，如组织、细菌、亚细胞蛋白质组[1,10,11]，分泌蛋白[12,13]，血清[14]等等。该技术既可用于分离蛋白质样品也可分离多肽样品，Uzozie等[15]对大肠腺瘤组织和正常肠黏膜组织及相关细胞系的总蛋白质进行酶切，之后采用稳定同位素8标试剂盒对样品进行标记，再用OGE分离多肽样品，经液质联用测试分析后，最终在组织里鉴定到4 325种非冗余蛋白质，在细胞中鉴定到2 017种非冗余蛋白质。在国内开展此项分离技术的实验室还不多，李贤煜等[9]以肝癌细胞系MHCC97L的无血清培养分泌蛋白质为研究对象，将分泌蛋白质酶切所得肽段进行OGE分离，再经液质联用鉴定了2 995个蛋白质。

图2　液质联用分析其中一个组分所得液相BPC图(A)、液相洗脱28.88 min时的一级质谱图(B)及m/z 709.39的二级质谱图(C)Figure 2　BPC diagram of one of the separated proteins from OGE(A), MS diagram at elution time of 28.88 min(B), and MS/MS diagram at m/z of 709.39(C) in LC-MS/MS

表1OGE各组分鉴定的蛋白质数目

Table 1Numbers of unique proteins in 12 fractions identified by OGE

样品编号鉴定蛋白个数样品编号鉴定蛋白个数样品编号鉴定蛋白个数S1-P148S5-P521S9-P235S2-P73S6-P652S10-P433S3-P266S7-P406S11-P348S4-P276S8-P420S12-P345

OGE与各种标记方法、液质联用、亲和富集和凝胶分析等上下游处理方法兼容，体现了该分离方法具有极强的灵活性。并且分离重复性好，可重复实验收集某一个组分的样品，从而富集该pH范围的低丰度蛋白质(或多肽)尤其便于对低丰度蛋白质进行分析，如各种细胞因子，血清去高丰度蛋白之后样品，细胞或组织分泌蛋白质组等等，用常规分离技术很难研究的样品，采用该技术进行分离、富集，从而为后续研究打下基础。

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Analysis of the total cell proteins of stem cells from human exfoliated deciduous teeth by OFFGEL electrophoresis

HU Jia1, LI Lei1, WANG Jinsong2, ZHAO Junpeng1*

(1MedicalExperimentandTestCenter,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2CapitalMedicalUniversitySchoolofBasicMedicalSciences;*Correspondingauthor,E-mail:jp75@mail.ccmu.edu.cn)Abstract：ObjectiveTo isolate and identify the total cell proteins of stem cells from human exfoliated deciduous teeth by OFFGEL electrophoresis and liquid chromatography with mass spectrometry(MS).MethodsThe total cell proteins were extracted from stem cells from human exfoliated deciduous teeth, and assigned into 12 sample wells for OFFGEL electrophoresis(OGE). The 12 protein fractions were obtained by liquid recovery, then isolated by SDS-PAGE and digested to the peptides, and finally identified by nano liquid chromatography-electrospray ionization-MS/MS(LC-ESI-MS/MS).ResultsThe map of SDS-PAGE revealed that the total cell proteins of stem cells from human exfoliated deciduous teeth were composed of 12 different fractions after OGE. A number of proteins from the 12 fractions were successfully identified by nano LC-ESI-MS/MS.ConclusionThe complex protein samples can be isolated, and the separated proteins are easy to be identified by LC-MS/MS.Key words:OFFGEL electrophoresis;total cell proteins;LC-MS/MS;proteome

首都医科大学科研基金资助项目(校技术类2014JS04)

胡家,女,1981-06生,硕士,主管技师,E-mail:hujia413@163.com

2015-12-22

Q503

A

1007-6611(2016)03-0250-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.013