锌指蛋白185在小鼠睾丸间质细胞的表达研究

2016-09-14尤新国李会平樊姝彤刘晓影陈丽梅潘智芳冯卫国

山西医科大学学报 2016年3期

关键词：贴壁睾丸消化

魏　露，尤新国，李会平，樊姝彤，刘晓影，陈丽梅，潘智芳*，冯卫国#

(1潍坊医学院细胞生物学教研室，潍坊　261053； *通讯作者，E-mail: pzhifang@163.com; #共同通讯作者，E-mail:sdaqfwg@126.com)

锌指蛋白185在小鼠睾丸间质细胞的表达研究

魏露1，尤新国1，李会平1，樊姝彤1，刘晓影1，陈丽梅1，潘智芳1*，冯卫国1#

(1潍坊医学院细胞生物学教研室，潍坊261053；*通讯作者，E-mail: pzhifang@163.com;#共同通讯作者，E-mail:sdaqfwg@126.com)

ZNF185；小鼠；睾丸间质细胞；分离；纯化；鉴定

ZNF185是一种C端含有两个串联结构的锌指蛋白，在生物体的发育、分化、癌变等过程中起着非常重要的作用[1]。精子发生是指精原细胞经过一系列分裂分化形成精子的复杂过程，受到众多基因和蛋白的调控[2]。睾酮在性分化、精子发生、性功能维持和促进附属性腺发育等方面发挥着重要作用[3]，而男性体内大约95%的睾酮是由睾丸间质细胞(Leydig cells)合成和分泌[4]。

本课题组前期研究发现，ZNF185在睾丸中含量高于其他组织，推测ZNF185可能与精子发生相关[5，6]。因此，分离得到高活性、高纯度的间质细胞是研究ZNF185功能的必要条件。本研究通过单酶消化法得到了间质细胞，差速贴壁法将其纯化，建立了一种有效的分离纯化睾丸间质细胞的方法，并采用PCR、Western blot和免疫荧光技术研究了ZNF185基因在间质细胞中的表达和定位，为进一步研究ZNF185在间质细胞中的功能奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料

4-5周龄雄性昆明小鼠，18-22 g，清洁级，购于潍坊医学院动物实验中心[SCXK(鲁)20140007]。DMEM/F12培养基购于Hyclone公司；胶原酶Ⅳ购于Invitrogen公司；四氮唑蓝和辅酶Ⅰ购于上海源叶生物科技有限公司；脱氢表雄酮购于Aladdin公司；反转录试剂盒和PCR试剂盒购于TaKaRa公司；RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、Actin抗体、免疫染色固定液和免疫染色封闭液等购于碧云天生物技术公司；兔抗小鼠ZNF185多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；FITC标记山羊抗兔IgG抗体购于天津三箭生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1小鼠睾丸间质细胞的分离、纯化和鉴定颈椎脱臼法处死小鼠，浸于75%乙醇中5 min，取出后放入消毒解剖盘中。眼科剪剪开腹部皮肤，取出睾丸，放入盛有PBS的平皿中，除去脂肪、附睾和睾丸表面的白膜等组织，轻轻拨散实质，移入离心管，加入0.75 mg/ml胶原酶Ⅳ，37 ℃水浴震荡消化15-20 min，加入4倍体积DMEM/F12完全培养基终止消化，取上清，200×g离心5 min，弃上清，DMEM/F12完全培养基洗涤细胞两次，加入适量DMEM/F12完全培养基，混匀，计数，将细胞稀释成5×106个/ml浓度的细胞悬液，接种于培养瓶或培养板中，37 ℃，5%CO2培养箱培养。分为无纯化组和有纯化组，无纯化组在培养24 h时换液，有纯化组在培养20 h时换液(即进行差速贴壁法纯化间质细胞)。以后每24 h换液1次。

采用3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxy-steroid-dehydrogenase，3β-HSD)[7]染色法鉴定睾丸间质细胞纯度。将无纯化组和有纯化组的细胞制成细胞涂片，室温下干燥2 h；将0.6 mg脱氢表雄酮、1 mg四氮唑蓝、9.5 ml PBS和10 mg 辅酶Ⅰ混匀后滴于涂片上；37 ℃染色60 min，随机取5张涂片，每张涂片取20个高倍镜视野，计算阳性率。

1.2.2PCR法检测ZNF185在小鼠睾丸间质细胞的表达细胞长满后，加入RNAiso Plus；按TaKaRa公司的总RNA提取及反转录试剂盒说明书提取细胞总RNA，并将细胞总RNA反转录为cDNA；接着分为实验组(加入模板)和空白组(不加模板)进行PCR，PCR反应条件：95 ℃4 min；95 ℃30 s，60 ℃1 min，72 ℃1 min共40个循环，72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物与凝胶电泳上样缓冲液混匀后，2%琼脂糖凝胶电泳，电压5 V/cm。引物序列为潘智芳课题组所用序列[5]。

1.2.3Western blot检测ZNF185在小鼠睾丸间质细胞的表达间质细胞长满后，常规消化收集细胞，加入适量蛋白裂解液，混匀，冰上裂解5 min；12 000×g离心5 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度后，加入6×Loading Buffer，混匀后沸水中煮5 min，从而获得间质细胞蛋白质样品(实验组)。同时，以相同的方法收集肝原代细胞的蛋白质样品(空白组)。按SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书，配制10%分离胶和4%浓缩胶，每孔加入60 μg样品，100 mV电泳分离总蛋白，200 mA恒流电转至PVDF膜上，Western封闭液室温摇床封闭1 h。按预染蛋白分子量标准指示线，剪开PVDF膜，分别滴加兔抗小鼠ZNF185多克隆抗体(1∶200稀释)和Actin抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜5 min×3次。分别滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶1 000稀释)和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶1 000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次，ECL显影。

1.2.4免疫荧光技术检测ZNF185在小鼠睾丸间质细胞的定位待间质细胞长至60%，取出无菌室，分为空白组和实验组。弃去培养基，均用37 ℃ PBS洗2次后滴加免疫染色固定液，室温固定10 min，PBS洗3 min×3次。两组均滴加免疫染色封闭液，37 ℃封闭1.5 h，弃去免疫染色封闭液。接着，空白组滴加新鲜免疫染色封闭液，实验组滴加兔抗小鼠ZNF185多克隆抗体(1∶200稀释)，两组样品均在4 ℃孵育24 h。第2天取出细胞，复温1 h。两组细胞都进行以下步骤：PBST洗5 min×3次；滴加FITC标记山羊抗兔IGg抗体(1∶200稀释)，37 ℃避光孵育1.5 h；PBST洗5 min×3次；滴加Propidium Iodide/碘化丙啶(1 mg/ml)染核3 min；PBST洗5 min×6次；滴加防淬灭封片剂封片，镜检，拍照。

1.2.5统计学方法每个实验至少重复三次，采用SPSS软件对实验数据进行独立样本t检验，P<0.001为差异有统计学意义。

2　结果

2.1原代培养结果和形态学观察

培养20 h时便可见呈梭形和不规则形贴壁的Ledig细胞，培养至48 h梭形细胞的比例加大，出现拉网生长现象。试验中发现，传代细胞5 h便可以以梭形贴壁；培养至24 h时便可见拉网生长的Ledig细胞(见图1)；而且细胞增值速度快，培养3-4 d便长至80%。

2.2睾丸间质细胞的纯度鉴定结果

图2结果显示，无纯化组多为未着色的透明细胞；有纯化组多为蓝紫色的Ledig细胞(见图2)；统计结果显示，无纯化组细胞中间质细胞含量为22%左右，有纯化组细胞中间质细胞含量为98%左右(见表1)，且无纯化组和有纯化组间质细胞纯度的差异具有统计学意义(P<0.001)，说明成功分离了高纯度的Ledig细胞。

图1　传代24 h的原代睾丸间质细胞的形态学观察Figure 1　The morphology of primary Leydig cells at 24 h

A.无纯化组　　　　　　　B.有纯化组图2　睾丸间质细胞3β-HSD染色Figure 2　Histochemical staining for 3β-HSD in Leydig cells

表1睾丸间质细胞纯度的鉴定(%)

Table 1The purity of Leydig cells with purification or not(%)

组别第一次第二次第三次无纯化22.81±9.2722.00±6.5722.40±8.26有纯化98.56±3.0897.50±7.8998.01±3.17t-76.1093-76.0631-86.7508P0.0010.0010.001

2.3睾丸间质细胞的PCR和Western blot结果

PCR和Western blot的结果显示，间质细胞中有ZNF185基因的表达(见图3)。

2.4睾丸间质细胞的免疫荧光结果

免疫荧光结果显示，ZNF185主要表达在间质细胞的细胞质(见图4)。

图3　间质细胞ZNF185表达结果Figure 3　The expression of ZNF185 in Leydig cells

A.实验组的绿色荧光显示ZNF185;B.实验组的红色荧光显示细胞核;C.实验组A与B的合成图;D.空白组的红色荧光显示细胞核图4　免疫荧光显示ZNF185在小鼠间质细胞中的定位Figure 4　The localization of ZNF185 detected by immunofluorescence

3　讨论

目前，分离间质细胞的方法有机械法[8]、组织块培养法[9]、单酶消化法[10]、双酶消化法[11]、联合机械法和双酶消化法[12]。机械法得到的悬浮细胞种类多，且因不断吹打细胞，对细胞损伤大，分离效果不理想。组织块培养法，存在组织块很难长出细胞、培养时间久和得到细胞少等问题。联合机械法和双酶消化法，得到的悬浮细胞种类多，进一步纯化难度大。双酶消化法，该方法是否对间质细胞功能造成影响，还需要进一步研究。本实验采用传统的单酶消化法分离间质细胞。取出睾丸后，小心剥离白膜，既能除去白膜对睾丸结缔组织的保护，使组织易于消化，又能防止曲细精管内部其他细胞的污染；胶原酶Ⅳ消化组织，在获得大量间质细胞的同时避免了因消化时间过久而造成的细胞存活率和活性低等问题。经实验验证，0.75 mg/ml的胶原酶Ⅳ，37 ℃消化15-20 min可得到大量间质细胞。

纯化间质细胞的方法有分离液(percoll)密度梯度离心法和差速贴壁法[13,14]。percoll密度梯度离心法是近年来常采用的纯化方法，但该方法操作复杂，增加了对Ledig细胞的损伤。本实验采用差速贴壁法纯化Ledig细胞，即在间质细胞贴壁后，其他细胞贴壁前进行换液。该方法仅用于大鼠间质细胞的纯化，未在小鼠间质细胞的纯化中采用，相关报道称睾丸间质细胞开始贴壁的时间为6-18 h不等[15-17]。经本实验验证，原代细胞培养20 h时换液，可有效除去杂细胞，得到纯度在98%的间质细胞。

1997年，Heiss等[1]通过定位克隆法得到ZNF185基因。近年来，多项研究表明ZNF185发挥着抑癌作用[18,19]。进一步研究发现，ZNF185基因在睾丸中的表达量高于其他组织，推测ZNF185可能与雄性生殖存在密切关系[5]，而睾丸间质细胞是在精子发生过程中发挥着重要作用的雄性激素的主要合成细胞。本研究采用PCR和Western blot技术证明，ZNF185基因在睾丸间质细胞中呈高表达。说明ZNF185基因可能与雄性激素的合成相关，进而与雄性生殖相关，但雄性激素的合成是受众多基因调控的，ZNF185是否涉及此过程还需进一步研究。肌动蛋白是细胞骨架蛋白，主要存在于细胞质中，并参与蛋白质的运输。近年的研究认为，ZNF185可以与肌动蛋白actin结合，发挥抑癌作用[20]。本研究采用免疫荧光技术证明，ZNF185主要表达于间质细胞的细胞质，是否ZNF185与雄性激素的分泌相关，是值得进一步研究的课题。总之，本研究首次在体外研究了ZNF185在间质细胞的表达与定位，为下一步研究ZNF185与雄性激素合成和分泌的关系提供了基础，而关于ZNF185功能的研究有望为拓展生殖调控机制，为男性避孕药的制备、研究提供新的分子靶点。

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Expression of ZNF185 in Leydig cells of mouse testis

WEI Lu1, YOU Xinguo1, LI Huiping1, FAN Shutong1, LIU Xiaoying1, CHEN Limei1, PAN Zhifang1*, FENG Weiguo1#

(1DepartmentofCellBiology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053，China；*Correspondingauthor，E-mail:pzhifang@163.com;#Co-correspondingauthor,E-mail:sdaqfwg@126.com)