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Id-1在结直肠癌中的表达及其临床意义

2016-09-14武雪亮王立坤杨东东杨瑞敏

山西医科大学学报 2016年3期
关键词:免疫组化直肠分化

武雪亮, 王立坤, 薛 军*, 杨东东, 屈 明, 郭 飞, 杨瑞敏, 刘 博

(1河北北方学院附属第一医院血管腺体外科,张家口 075000; 2河北北方学院附属第一医院超声医学科; 3河北北方学院附属第一医院病理科;*通讯作者,E-mail:yfyxuejun@163.com)



Id-1在结直肠癌中的表达及其临床意义

武雪亮1, 王立坤2, 薛军1*, 杨东东1, 屈明1, 郭飞1, 杨瑞敏2, 刘博3

(1河北北方学院附属第一医院血管腺体外科,张家口 075000;2河北北方学院附属第一医院超声医学科;3河北北方学院附属第一医院病理科;*通讯作者,E-mail:yfyxuejun@163.com)

目的研究DNA结合分化抑制蛋白1(Id-1)在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理参数间的相关性。方法选取我院结直肠癌和正常黏膜组织各50例,应用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测两组中Id-1 mRNA和蛋白质的表达情况,并应用免疫组化法(SP)检测Id-1在两组中的表达,分析Id-1在结直肠肿瘤发生、发展中的作用。结果结直肠癌组织中Id-1 mRNA的表达水平较正常组织高(0.96±0.03vs0.20±0.04,P=0.011);Id-1蛋白在结直肠癌组织中的表达水平亦较正常组织高(0.82±0.04vs0.31±0.02,P=0.020)。免疫组化显示Id-1在结直肠癌组织组中阳性表达明显高于正常黏膜中的表达,差异有统计学意义(72.00%vs24.00%,χ2=23.431,P=0.000)。Id-1表达与肿瘤浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移、肝转移及脉管浸润等密切相关(均P<0.01),而与肿瘤大小及分化程度无关(P>0.05)。结论Id-1的特异性高表达与结直肠腺癌的发生、发展具有较高的相关性,有望成为特异性较高的肿瘤标志物。

DNA结合分化抑制蛋白1;结直肠肿瘤;逆转录聚合酶链反应;Western blot;免疫组化

DNA结合分化抑制蛋白1(inhibitors of DNA binding-1,Id-1)是近年来研究较热的一种致癌基因, 动物实验表明其可促进细胞增殖,诱导肿瘤血管生成,促进肿瘤生长侵袭,加速肿瘤生长并转移[1,2]。目前已证实Id-1在乳腺癌、宫颈癌、食管癌等多种恶性肿瘤中呈高表达状态[3-5],但在结直肠方面研究较少。本研究通过对Id-1行免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blot分析检测,旨在探讨Id-1在结直肠癌中的表达情况及其与相关临床病理因素间的关系。

1 材料与方法

1.1病例资料

收集2012-05~2014-05河北北方学院附属第一医院血管腺体外科手术切除的结直肠癌组织50例和正常组织50例,癌组织取自癌灶中心处,另取标本残端切缘经病理证实为正常肠组织。全部病例均为原发性肿瘤,且术前未行新辅助放化疗等针对性治疗。其中男 ∶女为29 ∶21,年龄33-71岁,平均(51.2±2.9)岁;正常结直肠组织中,男 ∶女为28 ∶22,年龄33-69岁,平均(52.0±2.1)岁。两组一般资料具有可比性(P>0.05)。1.2主要试剂与实验方法

1.2.1主要试剂兔抗人单克隆浓缩型Id-1抗体(ab50932 R2-1G6),购于香港abcam公司;兔抗人GAPDH多克隆一抗(ab54621 R2-3)、羊抗兔二抗(ab5214 R2-2),购于美国Santa Cruz公司;总RNA提取试剂、反转录试剂盒、SDS-PAGE标准指示剂、BCA蛋白定量试剂盒均购自Fementas公司;RIPA试剂购自Solarbio公司;DAB显色剂购于TIANGEN公司。引物由TaKara生物工程公司合成。

1.2.2RT-PCR法检测Id-1 mRNA表达提取并测定总RNA浓度,设计Id-1上游引物:5′-CTGAGGCACTGGCGAGGAGA-3′,下游引物:5′-GAGAAGCACCAAACGTGACCAT-3′,扩增长度140 bp;GAPDH(内参)上游引物:5′-ACCCACTCCTCCACCTTGA-3′,下游引物:5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′,扩增长度:107 bp。反应体系:1×PCR Buffer 2.5 μl,dNTP 0.5 μl,cDNA模板2 μl,Taq酶1.25 U,上下游引物各1 μl,RNA酶抑制剂1 μl,反应总体积25 μl。根据试剂盒说明书操作进行扩增:以1 μlDNA样本作为模板,以去离子水为阴性对照模板;扩增条件为95 ℃预变性2 min;95 ℃10 s,退火温度15 s,72 ℃延伸45 s,共35个循环;最后72 ℃再延伸10 min。产物于2%琼脂糖凝胶后电泳分离,于紫外线灯下观察结果。

1.2.3Western blot法检测Id-1蛋白表达RIPA裂解液提取总蛋白并定量。取50 μg蛋白,置入5×缓冲液(4∶1),100 ℃水浴,5 min 3次,8%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,后转至PVDF膜,取出膜,加5%脱脂奶粉封闭,弃封闭液滴加特异性的一抗(Id-1:1∶1 500;GAPDH:1∶150)4 ℃孵育过夜,加TBST洗涤液,10 min 3次,滴加特异性二抗(1∶1 500)37 ℃孵育1 h,再次加入TBST洗涤液,10 min 3次,ECL法检测条带,进行密度定量分析。

1.2.4免疫组织化学染色检测Id-1蛋白表达10%甲醛溶液固定部分标本,石蜡包埋,切片厚度为4 μm,使用苏木精-伊红(hematoxylin-esin,HE)染色方法,病理诊断。切片经80 ℃烤箱烤片30 min,乙醇脱水,灭活内源性过氧化物酶,枸橼酸缓冲液高温高压水化修复;PBS洗3次,加一抗,4 ℃过夜;PBS洗3次,加二抗。室温下DAB显色,苏木精轻度复染,并用1%的盐酸乙醇分化5 min、流水冲5 min、梯度乙醇脱水、松节油透明5 min,最后树胶封片,阴性对照为PBS代替一抗。

Id-1阳性表达的判定:细胞质中染有棕黄色,褐色颗粒为阳性细胞,计算阳性细胞百分比并评分,≤5%为0分,6%-25%为1分,26%-50%为2分,51%-75%为3分,>75%为4分;无着色:0分,浅黄色:1分,黄色:2分,深黄色:3分。两者相乘,0分为(-),1-4分为(+),5-8分为(++),9-12分为(+++),(+)-(+++)均视为阳性。

2 结果

2.1Id-1的RT-PCR检测结果

以Id-1/GAPDH比值作为RT-PCR定量分析,癌组织中Id-1 mRNA 的表达水平明显高于结直肠正常组织,差异具有统计学意义(0.96±0.03vs0.20±0.04,P=0.011,见图1)。

1,3.结直肠癌组; 2,4.结直肠正常组图1 RT-PCR检测结直肠癌及正常肠黏膜组织Id-1 mRNA的表达Figure 1 Expression level of Id-1 mRNA in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by reverse-transcription polymerase chain reaction

2 2Id-1的Western blot检测结果

以Id-1/GAPDH比值做蛋白定量检测,Id-1蛋白在结直肠癌组织中的表达水平亦较结直肠正常组织高,差异具有统计学意义(0.82±0.04vs0.31±0.02,P=0.020,见图2)。

1,3. 结直肠癌组; 2,4.结直肠正常组  图2 Western blot印迹法检测结直肠癌及正常黏膜组织Id-1蛋白的表达Figure 2 Expression level of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by Western blot

2.3Id-1的免疫组化检测结果

Id-1在结直肠癌组织组阳性表达率是72.00%(36/50),明显高于正常黏膜的24.00%(12/50),差异具有统计学意义(χ2=23.431,P=0.000,见图3及表1)。

2.4Id-1蛋白与临床病理参数之间的关系

Id-1蛋白的表达水平与患者肿瘤大小、分化程度无关,而与肿瘤浆膜浸润、肝转移、淋巴结转移、肿瘤TNM分期、脉管浸润密切相关(P<0.01,见表2)。

A.结直肠正常组织            B.结直肠癌组织 图3 免疫组化检测结直肠组织中Id-1蛋白的表达 (SP,×200)Figure 3 Expression level of Id-1 protein in colorectal tissues detected by immunohistochemistry (SP,×200)

表1Id-1蛋白在结直肠癌组织及正常组织中的表达(例)

Table 1Positive expression of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues(cases)

组别nId-1-++++++χ2P正常组503874123.4310.000癌组501461119

3 讨论

Id-1系螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)转录因子家族重要成员,是细胞分化的负性调控因子,其广泛表达于哺乳动物的胚胎、生殖腺体及一些分化不成熟的组织细胞中,在正常组织中呈微量表达或不表达状态,而在诸多恶性肿瘤及体外培养的肿瘤细胞系中高表达,且与肿瘤的恶性潜能及预后相关[6]。大多数HLH结构存在一个碱性HLH(bHLH)因子与其紧密相邻,二者相互结合形成异质二聚体与目标DNA结合,诱导启动子中的E-盒样结构的靶基因转录并整合成所谓的“E-box”DNA序列,从而调控细胞增殖分化[7]。

Id-1通过多种途径促进细胞增殖及侵袭。研究

证实,Id-1通过与E2A结合形成特异性复合物抑制E2A活化P21,激活CDK2诱导Rb蛋白磷酸化,抑制细胞分裂周期中G1/S停滞,促使细胞分裂周期顺利进行[8]。Id-1表达上调能促进TGF-β1的表达,进而下调E-钙黏蛋白表达,诱导上皮细胞间质化,导致细胞间极性消失、黏附力下降,使肿瘤细胞突破基底膜屏障,向邻近组织迁移、浸润[9,10]。

本实验结果显示Id-1mRNA和蛋白在腺癌组织中的表达明显高于正常组织,证实Id-1特异性高表达可能在结直肠癌的发生、发展中发挥重要作用。Pillai等[11]研究表明Id-l在非小细胞肺癌组织中的表达随肿瘤浸润深度的加深而逐步增高,随着淋巴结和远处转移而增强,在TNM Ⅲ和Ⅳ期的肺癌组织中表达较高。李晓梅等[12]对60例食管鳞癌组织行免疫组化检测显示Id-1在食管鳞癌组织中的阳性表达明显高于正常食管黏膜。朱博等[13]研究证实,Id-1在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜和胃癌组织中的阳性表达呈逐步上升趋势,且差异明显,且与肿瘤分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移和预后明显相关,Id-1阳性患者生存期明显低于阴性者。深入研究发现:结直肠癌伴浆膜浸润者较未侵及浆膜者Id-1蛋白表达明显增高;伴肝转移、淋巴结转移、血管浸润者较无转移浸润者Id-1蛋白表达明显增高;TNM分期越高,Id-1蛋白表达也越高,表明Id-1蛋白表达水平与结直肠肿瘤的恶性生物学行为密切相关,对结直肠癌的侵袭、转移有促进作用。郭云等[14]对62例直肠癌组织性免疫组化检测发现Id-1在癌组织中呈100%阳性染色,与肿瘤浸润深度、淋巴结转移密切相关,且与Ki-67和VEGF亦呈正相关性,考虑Id-1与Ki-67和VEGF具有协同作用;胡斌等[15]研究显示结直肠癌中Id-1能上调MT1-MMP的表达水平,使MMP-2、MMP-9等基因金属酶类过表达,促进基底膜的降解,加速癌细胞的浸润转移;此外,研究证实[10],Id-1还能通过促进VEGF表达、抑制TSP-1表达两方面共同作用,诱导肿瘤新生血管的形成,为肿瘤的生长、浸润和转移提供营养基础。

表2Id-1在结直肠癌组织中的表达及与相关临床病理指标的关系

Table 2Expression of Id-1 in colorectal adenocarcinoma tissues and its correlation with clinical pathological features

病理参数nId-1-+阳性率(%)χ2P肿瘤大小0.0430.836 ≥5cm3192270.97 <5cm1951473.68分化程度0.0740.964 高123975.00 中2161571.43 低1751270.59浆膜浸润4.5210.034 有3993076.92 无115654.55TNM分期7.0440.008 Ⅰ+Ⅱ136753.84 Ⅲ+Ⅳ3782978.38淋巴结转移15.2530.000 有2922793.10 无2112942.86肝转移8.3330.003 有15015100.00 无351421 60.001脉管浸润4.0790.043 有16215 93.75 无341221 61.76

综上所述,Id-1的高表达与结直肠癌的发生、发展及其恶性生物学行为具有高度的相关性,因而Id-1有望成为新的肿瘤监测指标,为临床诊治及预后监测提供重要的参考。本实验仅对Id-1在结直肠癌中的表达及与临床病理特征的关系做出了相关研究,但对其致癌机制、作用通路未有相应研究,对Id-1抑制剂的应用是否可抑制细胞增殖的研究尚未有相关实验加以证实,这也将是本课题进一步的研究方向。

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Expressions of Id-1 in colorectal adenocarcinoma tissues and its clinical significance

WU Xueliang1, WANG Likun2, XUE Jun1*, YANG Dongdong1, QU Ming1, GUO Fei1, YANG Ruimin2, LIU Bo3

(1DepartmentofVascularGland,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China;2DepartmentofUltrasound,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity;3DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:yfyxuejun@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of Id-1 in human colorectal adenocarcinoma tissues and explore their correlation with clinical pathological parameters of colorectal cancer.MethodsThe expression levels of Id-1 mRNA and protein in 50 specimens of normal colorectal tissues, and 50 specimens of colorectal adenocarcinoma tissues were detected using reverse-transcription polymerase chain reaction and Western blot. Meanwhile Id-1 protein was detected using immunohistochemistry. The correlation between Id-1 expression and the clinical pathological features was analyzed.ResultsThe expression level of Id-1 mRNA in colorectal adenocarcinoma tissues and normal colorectal tissues were 0.96±0.03 and 0.20±0.04, and there was significant difference(P=0.011).The expression of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma tissues was higher than that in normal colorectal tissues(0.82±0.04vs0.31±0.02,P=0.020).The positive expression rate of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma tissues was higher than that in normal colorectal tissues (72.00%vs24.00%,χ2=23.431,P=0.000).Expression of Id-1 was correlated with the depth of tumor invasion,TNM stage,lymph node metastasis,vessel invasion,and liver metastasis(P<0.01),but not with the tumor size and differentiation degrees(P>0.05).ConclusionThe high expression of Id-1 in colorectal adenocarcinoma tissues plays an important role in the process of cancer, and is expected to become a new tumor monitoring indicator for clinical diagnosis and treatment and prognosis judgment.Key words:Id-1;colorectal neoplasms;RT-PCR;Western blot;immunohistochemistry

河北省卫计委医学科学研究重点课题计划资助项目(20150058); 河北省科技支撑计划资助项目( 152777237); 河北省张家口市科技局指令性计划资助项目(1311055D)

武雪亮,男,1984-09生,硕士,主治医师,E-mail:wxlwlk@163.com

2015-11-12

R735.37

A

1007-6611(2016)03-0228-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.008

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