芎柰抗骨关节炎有效部位研究

2016-09-14郭嘉俊张小灵张慧迪时军广东药科大学中药学院广东广州510006

广东药科大学学报 2016年4期

郭嘉俊，张小灵，张慧迪，时军（广东药科大学中药学院，广东广州510006）

芎柰抗骨关节炎有效部位研究

郭嘉俊，张小灵，张慧迪，时军
（广东药科大学中药学院，广东广州510006）

目的研究川芎山柰抗关节炎作用的有效部位。方法利用小鼠热板法、乙酸扭体法和二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型，比较芎柰水提物、醇提物的抗炎镇痛作用；采用木瓜蛋白酶诱导大鼠骨关节炎模型，比较不同溶剂萃取物的抗炎作用。结果在相同剂量下，芎柰醇提物镇痛作用较水提物强（P＜0.05）；芎柰醇提物乙酸乙酯萃取物能有效减轻骨关节炎大鼠踝关节宽度和足趾肿胀（P＜0.01），显著降低血清IL-1β和NO水平（P＜0.01），改善其病理学改变。结论芎柰醇提物具有明显的抗炎镇痛作用，其乙酸乙酯部位是芎柰抗关节炎的最有效部位。

芎柰；抗骨关节炎；有效部位

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是临床上常见的一种退变性关节病，发病率约为总人口的15%，主要表现为持续性的关节疼痛，病情严重者可导致肌肉萎缩及关节畸形［1］。中医学称OA为骨痹，病因肝肾亏虚、风寒湿邪侵袭、淤血痰浊所致，属本虚标实之证。目前临床治疗OA，常用手术治疗和药物治疗，手术治疗较为痛苦，化学药物以改善症状为主，但不宜长期使用，并难以从根本上逆转OA的病理发展［2］。中医药治疗OA主要从祛风散寒、活血化瘀、行气止痛入手，疗效确切。川芎和山柰是常用的行气止痛药，据报道，川芎和山柰经陈醋浸泡，粉末局部贴敷，治疗OA疗效显著［3］。本研究从醋炙川芎和山柰入手，筛选抗OA的有效部位，为开发芎柰透皮制剂提供科学依据。

1　材料

1.1主要仪器

501超级恒温水浴（金坛市宏华仪器厂）；打孔器（北京众实迪创科技发展有限责任公司）；PV-200足趾容积测量仪（成都泰盟科技有限公司）；游标卡尺（上海恒胜工具有限公司）；OLYMPUS CKX41（日本Olympus光学仪器有限公司）；ELX800全自动酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.2试药

川芎Ligusticum chuangxiong Hort、山柰Kaempferia galanga L均购自安徽归然药业，批号20150817，经广东药科大学中药学院中药资源系马鸿雁副教授鉴定为2015年版中国药典正品；陈醋（山西四眼井酿造实业有限公司，批号20150910）；木瓜蛋白酶（上海蓝季生物有限公司，批号140314）；双氯芬酸二乙胺乳胶剂（北京诺华制药有限公司，批号X4014）；NO试剂盒（上海通蔚实业有限公司，批号201508）；IL-1β试剂盒（上海通蔚实业有限公司，批号201508）；二甲苯、冰乙酸、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇等试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3实验动物

SPF级KM小鼠（20±2）g，雌雄各半，广州中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（粤）2015-0004；SPF级SD大鼠（200±20）g，雌雄各半，广州中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（粤）2015-0020。

2　方法

2.1样品的制备

分别称取川芎、山柰饮片适量，按5∶1的比例醋炙后，晾干。称取醋炙芎柰适量，粉碎成粗粉，分别用10倍量的70%（φ）乙醇和蒸馏水加热回流提取3次，每次提取2 h，滤过，合并各提取液，减压回收乙醇和水，得到芎柰醇提物浸膏（得率42.15%）和水提物浸膏（得率61.92%）。取芎柰醇提物浸膏适量，用蒸馏水分散后，按1∶1的比例依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并各萃取液，减压回收各有机试剂及水，浓缩，得到石油醚萃取物（得率2.38%）、乙酸乙酯萃取物（得率2.05%）、正丁醇萃取物（得率2.55%）及剩余水层物（得率31.38%）。

2.2二甲苯所致小鼠耳廓肿胀实验［4］

取小鼠72只，雌雄各半，随机分为6组，分别为空白组、扶他林2.00 g/kg组、醋炙芎柰水提物高、低剂量组（74.30、37.15 g/kg），醋炙芎柰水提物高、低剂量组（50.58、25.29 g/kg）。适应性喂养2 d后给药。给药前1 d，将小鼠背部脱毛约4 cm×2 cm。实验时，将实验药品加适量凡士林，敷在小鼠背部脱毛皮肤上，摊成约4 cm×2 cm×0.1 cm的薄片，空白组给予适量凡士林，每天给药1次，连续给药7 d。末次给药后1.5 h，右耳廓两面滴二甲苯溶液每耳30 μL致炎，20 min后，脱颈臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径0.6 cm打孔器取左右耳廓同一部位圆耳片，电子天平称质量，计算两耳廓片质量之差为肿胀度。

2.3乙酸所致小鼠扭体反应实验［4］

取小鼠72只，雌雄各半，随机分为6组，按照“2.1”小鼠给药方法，每天给药1次，连续给药7 d。于末次给药后1.5 h，给予每只小鼠腹腔注射0.6% （φ）冰乙酸10 mL/kg，观察小鼠15 min内的扭体次数（腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高）。

2.4热刺激所致小鼠疼痛反应实验［4］

取雌性小鼠72只，先用热板进行合格小鼠筛选，调节温度（55±0.5）℃，取给药前痛阈值在5～30 s内的合格小鼠，随机分为6组，按照“2.1”给药方法，每天给药1次，连续给药7 d。于末次给药30、60、90 min后分别记录小鼠给药后的痛阈值，计算痛阈值提高百分率。

2.5木瓜蛋白酶所致OA模型大鼠实验

2.5.1大鼠OA模型的制备及给药取大鼠42只，雌雄各半，随机分为7组，分别为正常对照组、模型组、扶他林0.67 g/kg组、石油醚萃取物1.43 g/kg组、乙酸乙酯萃取物1.23 g/kg组、正丁醇萃取物1.53 g/kg组、剩余水层物18.83 g/kg组。适应性喂养2 d后，开始造模。造模前1 d，将大鼠左后足膝关节以下脱毛，分别在第2、5、8天于模型组和各给药组大鼠左后足跖皮内注射0.1 mL 4%木瓜蛋白酶生理盐水溶液，诱导OA大鼠模型，正常对照组大鼠左后足跖皮内于上述时间点注射等量生理盐水，术后不固定伤肢，自由活动。造模成功后，将实验药品加适量凡士林，敷在大鼠左后足脱毛皮肤上，正常对照组给予适量凡士林，每天给药2次，连续给药4周。2.5.2 观察指标观察各组大鼠的摄食量、活动情况、毛色、大小便等；测量造模前后每周大鼠体质量；分别于给药第1、2、3、4周求出大鼠的关节肿胀度和足趾肿胀度。用游标卡尺测量大鼠左后踝关节的宽度，用足趾容积测量仪测量大鼠左后踝关节以下的容积，测量3次取平均值，按照以下公式求出关节肿胀度和足趾肿胀度。

关节肿胀度（mm）=致炎后踝关节宽度-致炎前踝关节宽度

足趾肿胀度（mL）=致炎后左后踝关节以下的容积-致炎前左后踝关节以下的容积

2.5.3血清中IL-1β、NO指标测定连续给药4周后，腹主动脉采血，分离血清，用ELISA法分别测定血清中的IL-1β和NO含量，操作均严格按照试剂盒说明书进行。

2.5.4病理切片观察大鼠腹主动脉采血后，剥离左后踝关节，10%（φ）甲醛固定，10%EDTA脱钙，常规包埋，切片，HE染色后光镜下观察病理组织学变化。2.6 统计学分析

3　结果

3.1芎柰水提物和醇提物的抗炎镇痛作用

与空白组比较，扶他林组、芎柰水提物高、低剂量组，醇提物高、低剂量组的耳廓肿胀度水平均明显降低（P＜0.01），醇提物组优于水提物组（P＜0.05）；与空白组比较，扶他林组、水提物高剂量组，醇提物高、低剂量组的痛阈提高百分率水平均明显提高（P ＜0.01），醇提物组优于水提物组（P＜0.05），水提物低剂量组在30、60 min均能提高（P＜0.05），但在90 min时痛阈提高百分率差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组比较，扶他林组、水提物高、低剂量组、醇提物高、低剂量组的扭体次数水平均明显提高（P＜0.01），醇提物组优于水提物组（P＜0.01），水提物低剂量组扭体次数差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.2芎柰不同极性溶剂萃取物的抗OA作用

3.2.1一般情况观察各组大鼠在摄食量、活动情况、毛色、大小便等方面无明显差异。造模前后每周测量大鼠体质量，同实验阶段大鼠体质量差异无统计学意义。

3.2.2大鼠关节肿胀度的变化与模型组比较，扶他林组、乙酸乙酯萃取物组、正丁醇萃取物组从第2周起能显著减少关节肿胀度（P＜0.01），乙酸乙酯萃取物组优于正丁醇萃取组（P＜0.05）；石油醚萃取物组和剩余水层组的关节肿胀度差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1　芎柰水提物和醇提物的抗炎镇痛作用比较Table 1 Effect of water and alcohol extracts from Xiongnai on anti-inflammation and analgesia（，n=12）

组别　　剂量/ （g·kg-1）耳廓肿胀度/ mg痛阈提高百分率/%扭体次数30 min　60 min　90 min空白组　-　19.83±5.94##　17.52±2.51#　20.51±13.63#　20.26±5.82　38.33±2.27##扶他林组　2.00　8.27±3.32**##　97.15±31.13**##109.62±30.56**##　96.58±28.31**##　19.55±1.97**##水提物组　74.30　12.08±3.09**　52.37±13.11**　60.69±23.92**　55.71±25.33**　29.08±1.68**37.15　14.92±4.34**　39.62±8.07*　48.32±12.45*　39.02±11.69　34.83±1.19**醇提物组　50.58　10.36±5.10**#　86.96±9.13**##　91.53±10.36**#　87.06±12.24**##　22.27±1.27**##25.29　11.50±3.85**　64.07±19.88**#　74.30±25.56**#　65.60±25.80**#　26.33±1.50**##

表2　芎柰不同萃取物的大鼠关节肿胀度比较Table 2 Effect of different extracts of Xiongnai on articular swelling in rats with osteoarthritis（，n=6）

组别　　剂量/ （g·kg-1）关节肿胀度/mm给药前　　第1周　　第2周　　第3周　　第4周正常对照组　-　0.065±0.025△△**0.083±0.047△△**　0.023±0.034△△**　0.027±0.027△△**　0.025±0.021△△模型组　-　1.142±0.160　1.262±0.174　1.227±0.250**　1.460±0.364**　1.410±0.476**扶他林组　0.67　1.115±0.177　0.588±0.179△△*　0.240±0.243△△**　0.142±0.156△△**　0.137±0.108△△石油醚萃取物组　1.43　1.150±0.186　1.398±0.194*　1.515±0.241**　1.355±0.338**　1.267±0.300**乙酸乙酯萃取物组　1.23　1.383±0.507　0.900±0.489△　0.367±0.231△△*　0.222±0.125△△**　0.092±0.053△△正丁醇萃取物组　1.53　1.232±0.341　1.005±0.365　0.752±0.282△△　0.655±0.275△△　0.295±0.152△△剩余水层物组　18.83　1.190±0.120　1.423±0.187*　1.327±0.339**　1.187±0.296**　1.390±0.231**

表3　芎柰不同萃取物的大鼠足趾肿胀度比较Table 3 Effect of different extracts of Xiongnai on toe swelling in rats with osteoarthritis（，n=6）

与模型组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01；与正丁醇萃取物组比较:*P＜0.05，**P＜0.01。

组别　　剂量/ （g·kg-1）足趾肿胀度/mL给药前　　第1周　　第2周　　第3周　　第4周正常对照组　-　0.060±0.047△△**0.077±0.046△△**　0.047±0.035△△**　0.058±0.047△△*　0.052±0.049△△模型组　-　0.287±0.169　0.277±0.153　0.385±0.174**　0.423±0.166**　0.373±0.239**扶他林组　0.67　0.285±0.145　0.153±0.088△*　0.082±0.028△△*　0.123±0.082△△　0.087±0.068△△石油醚萃取物组　1.43　0.280±0.058　0.277±0.081　0.355±0.095　0.308±0.135　0.287±0.080*乙酸乙酯萃取物组　1.23　0.270±0.069　0.140±0.076△△*　0.092±0.052△△*　0.082±0.029△△　0.050±0.020△△正丁醇萃取物组　1.53　0.280±0.081　0.268±0.099　0.212±0.099△△　0.190±0.109△△　0.147±0.114△△剩余水层物组　18.83　0.283±0.053　0.278±0.053　0.295±0.062　0.308±0.043　0.257±0.078

3.2.3大鼠足趾肿胀度的变化与模型组比较，扶他林组、乙酸乙酯萃取物组第1周足趾肿胀度减少（P＜0.05），从第2周起，扶他林组、乙酸乙酯萃取物组、正丁醇萃取物组足趾肿胀度均明显减少（P＜0.01），乙酸乙酯萃取物组优于正丁醇萃取组（P＜0.05）；石油醚萃取物组和剩余水层组的足趾容积变化差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3.2.4大鼠血清IL-1β与NO含量的变化与模型组比较，扶他林组、乙酸乙酯萃取物组、正丁醇萃取物组能显著减少大鼠血清中IL-1β、NO含量（P＜0.01），石油醚萃取物组和剩余水层物组血清IL-1β、NO含量差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4　芎柰不同萃取物的大鼠血清中IL-1β与NO含量比较Table 4 Effect of different extracts of Xiongnai on the serum levels of IL-1β and NO in rats with osteoarthritis （，n=6）

与模型组比较:△△P＜0.01。

组别　　剂量/ （g·kg-1）ρ（IL-1β）/ （ng·L-1）ρ（NO）/ （ng·L-1）正常对照组　-　44.99±3.38△△32.00±4.35△△模型组　-　106.53±6.25　46.87±4.05扶他林组　0.67　52.73±6.74△△36.25±3.48△△石油醚萃取物组　1.43　100.69±11.23　46.40±1.71乙酸乙酯萃取物组　1.23　59.63±3.47△△40.19±5.32△△正丁醇萃取物组　1.53　60.67±6.92△△40.41±2.16△△剩余水层物组　18.83　101.12±6.93　46.80±4.72

3.2.5芎柰不同萃取物对OA大鼠踝关节病理的影响正常对照组大鼠左踝关节滑膜组织中没有炎症细胞浸润，关节软骨没有受到破坏；模型组、石油醚萃取物组、剩余水层组的大鼠左踝关节滑膜组织中出现大量炎性细胞，关节腔间隙变窄，关节软骨发生破坏；扶他林组、乙酸乙酯萃取物组、正丁醇萃取物组可见少量炎性细胞，关节间隙稍变窄，关节软骨未见明显破坏。见图1。

图1　芎柰不同萃取物对OA模型大鼠踝关节损伤的影响（HE，100×）Figure 1 Effects of different extracts of Xiongnai on ankle injury in rats with osteoarthritis（HE，100×）

4　讨论

目前，用于治疗OA的化学药物常用非甾体类抗炎药物，可以有效改善膝关节疼痛、肿胀，但不能从根本上逆转OA的病理发展，且长期服用易导致消化道与肾脏的不良反应，因而仅在急性期使用［5］。糖皮质激素对中晚期OA有良好的作用，但多次注射加重骨关节的损害［6］。改善软骨代谢药物硫酸软骨素等能有效缓解软骨退变，强化软骨结构，延缓OA发展，但也存在一定的不良反应，对于OA的治疗价值有待进一步研究与探讨［7］。

疼痛和关节僵直是OA的两大典型症状。OA的药效实验常用诱发模型及自发模型［8］，其检测指标主要有与组织结构性成分有关的指标和分子标志物，包括胶原、蛋白聚糖、金属蛋白酶系统、细胞因子、炎症信息分子等［9］。本文运用抗炎镇痛实验，证明醋炙芎柰醇提物优于水提物；并运用醋炙芎柰不同极性溶剂萃取物进行抗OA实验，选择血清中的细胞因子IL-1β和NO为检测指标，结合病理切片，证明乙酸乙酯部位是醋炙芎柰的最有效部位。

研究发现，川芎中川芎嗪、阿魏酸、大黄酸均具有抗炎等作用，均能明显降低OA模型大鼠/小鼠的关节液、血液中NO含量水平，阿魏酸还能降低关节液、血浆中丙二醛（MDA）水平，增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，对减轻OA炎症有一定的作用［10-12］。山柰中的山柰酚、芦丁能够通过抑制NO的产生从而降低炎症反应中TNF-α等促炎性因子的表达来达到抗炎的效果［13-14］。川芎山柰乙酸乙酯部位抗OA活性，是否是这些成分的整体协同作用，以及具体的抗OA作用机制，有待进一步研究。

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（责任编辑：幸建华）

Study of the effective parts of Xiongnai on anti-osteoarthritis

GUO Jiajun，ZHANG Xiaoling，ZHANG Huidi，SHI Jun
（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the effective parts of Xiongnai on anti-osteoarthritis.Methods Three kinds of mice models including hot-plate test，acetic acid-caused writhing response and xylene-induced ear swelling were used to test the activity of water and alcohol extracts from Xiongnai on anti-inflammatory and analgesic effects.The rat model of papain-induced osteoarthritis was used to test the effect of different solvent extracts on anti-inflammatory effects.Results Alcohol extract from Xiongnai displayed a better anti-inflammatory and analgesic effects than that in water extract under the same dose.The ethyl acetate group effectively relieved the width of the ankle and toes swelling（P＜0.01），decreased the serum levels of IL-1β and NO （P＜0.01），and improved the pathology damage.Conclusion The alcohol extract of Xiongnai exhibits an apparent anti-inflammatory and analgesic activity，and the ethyl acetate extract of Xiongnai is the most effective part on anti-osteoarthritis.

Xiongnai；anti-osteoarthritis；effective parts

R285

1006-8783（2016）04-0470-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016042702

2016-04-27

广东省科技攻关计划项目（2014A020212417）

郭嘉俊（1991—），男，2014级硕士研究生，Email:guojj3354@163.com；通信作者:时军（1980—），男，博士，副教授，主要从事中药新药及制剂新技术研究，电话:020-39352169，Email:shijun8008@163.com。

网络出版时间:2016-07-11 14:29:40 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1429.003.html