双氢青蒿素促胃癌细胞凋亡的作用

尤琪，张卉宁，黎昆东，张巨峰（广东药科大学.中药学院；.生命科学与生物制药学院，广东广州50006）

双氢青蒿素促胃癌细胞凋亡的作用

尤琪1，张卉宁2，黎昆东2，张巨峰2
（广东药科大学1.中药学院；2.生命科学与生物制药学院，广东广州510006）

目的研究双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）对人胃癌细胞 （SGC-7901、HGC-27）生长抑制和促凋亡的作用。方法用WST-1方法检测DHA处理后的胃癌细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况，细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。结果 不同浓度的DHA可以抑制胃癌细胞（SGC-7901、HGC-27）的增殖，且呈现浓度依赖性增长趋势。DHA作用48 h后，胃癌细胞的周期阻滞在S期，同时有诱导胃癌细胞凋亡的作用；DHA作用24 h和48 h后，对胃癌细胞的迁移能力有抑制作用。结论DHA可有效地抑制胃癌细胞的增殖，并促进其凋亡。

双氢青蒿素；胃癌细胞；细胞增殖；细胞凋亡

根据2013年“全球癌症负担系列研究”统计的癌症数据显示，在中国，胃癌的发病率26.84%，死亡率23.55%，均高于全球水平，分别位居肿瘤发病率的第2位、死亡率的第3位［1］。目前，治疗胃癌以手术并结合药物化疗为主，但较高的复发率以及化疗药物引起的并发症等缺点［2］，使多靶点治疗、毒副作用较小的中药及其单体成为潜在的抗肿瘤药物［3-4］。青蒿素是中药植物青蒿中提取的环状倍半萜类化合物，具有良好的抗恶性疟疾作用，由于难溶于水，影响了其疗效的发挥，因此合成了抗疟效价高、速效、低毒的青蒿素衍生物——双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）。近年来发现，DHA对肝癌、宫颈癌、骨肉瘤等肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用［5-8］，但关于胃癌细胞的研究尚未报道。本实验以人胃癌细胞系作为研究对象，研究DHA抑制胃癌细胞增殖的作用，为中药抗肿瘤药物的开发提供依据。

1　材料与方法

1.1主要试剂

双氢青蒿素（奥伦生物公司）；Opti-MEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（Life TechnologiesTM公司）；0.25%胰酶溶液（美国Technologies公司）；PBS磷酸缓冲液（美国ThermoFisher公司）；WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天公司）。

1.2方法

1.2.1WST-1实验 取对数生长期的胃癌细胞，调整细胞的浓度为105/mL，取100 μL接种于96孔板。细胞贴壁后，加入不同浓度的DHA（0.78、1.56、3.13、6.25、12.50 μmol/L），每个浓度设4个平行孔，继续培养48 h，每孔加入10 μL WST-1溶液，37℃继续培养3 h，测定450 nm处的各孔吸光值 （A值）。按照公式，抑制率=1-×100%，计算细胞增殖抑制率。绘制以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标的细胞增殖抑制图。

1.2.2流式细胞仪检测细胞周期 采用PI染色法检测细胞周期，取胃癌细胞3×105/孔接种于6孔板中，设未处理的胃癌细胞为对照组，经过DHA处理的作为处理组。分别以DHA浓度为6.25 μmol/L的作用于SGC-7901细胞，浓度为1.56 μmol/L的作用于HGC-27细胞，经过48 h处理后，收集细胞，用PBS洗涤细胞3次，加入预冷的70%（φ）乙醇，4℃固定过夜，加入PBS洗涤2次，弃上清后每管加入PI工作液，混匀细胞，然后在室温下避光孵育30 min后上流式细胞仪检测。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡 取胃癌细胞3× 105/孔接种于6孔板中，分别设置对照组和处理组，作用于细胞48 h后，收集细胞于流式管中，预冷的PBS洗涤2次，加入195 μL的Annexin V-FITC结合液，轻轻重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，室温避光孵育10～20 min，上流式细胞仪进行检测。

1.2.4划痕实验 用记号笔在6孔板背后用直尺均匀地划横线，每条线相隔约0.5～1 cm，横穿过每孔。其中每孔至少穿过5条线。取对数生长期的胃癌细胞，调整细胞浓度3×105/mL，以每孔2 mL的接种量接种于6孔板中，培养24 h，加入DHA后分别培养24 h、48 h，在显微镜下观察细胞迁移情况。采用软件Image-Pro Plus测量细胞划痕的距离，划痕愈合率=（0 h划痕宽度-12 h或24 h划痕宽度）/ 0 h划痕宽度×100%。

1.2.5统计学处理 使用SPSS12.0统计学软件，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1DHA对胃癌SGC-7901、HGC-27细胞增殖的抑制作用

与对照组相比，DHA能显著抑制胃癌细胞SGC-7901、HGC-27细胞的生长，且随着药物浓度的增加，具有明显的剂量依赖性（P＜0.05，P＜0.01）。DHA对SGC-7901、HGC-27细胞的生长抑制曲线见图1、图2。

图1　DHA对SGC-7901细胞增殖的抑制作用Figure 1 Effect of DHA on SGC-7901 cell growth

图2　DHA对HGC-27细胞增殖的抑制作用Figure 2 Effect of DHA on HGC-27 cell growth

2.2DHA对胃癌SGC-7901、HGC-27细胞周期的影响

与对照组相比，DHA作用48 h后，SGC-7901和HGC-27细胞的S期比例增加，分别增加了22.66%、9.03%，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。结果表明，DHA可促使SGC-7901和 HGC-27细胞阻滞在S期。见图3、4。

图3　流式细胞仪检测DHA对SGC-7901细胞周期的影响Figure 3 Effect of DHA on cell cycle of SGC-7901 cells by FCM

图4　流式细胞仪检测DHA对HGC-27细胞周期的影响Figure 4 Effect of DHA on cell cycle of HGC-27 cells by FCM

2.3DHA对胃癌SGC-7901、HGC-27细胞凋亡的影响

经过48 h的DHA处理后，与对照组相比，SGC-7901细胞凋亡细胞增加了7.59%，HGC-27细胞凋亡增加了12.65%，提示DHA对胃癌细胞具有明显的凋亡作用（P＜0.01）。

图5　流式细胞仪检测DHA对SGC-7901细胞凋亡的影响Figure 5 Effect of DHA on cell apoptosis in SGC-7901 cells by FCM

图6　流式细胞仪检测DHA对HGC-27细胞凋亡的影响Figure 6 Effect of DHA on cell apoptosis in HGC-27 cells by FCM

2.4DHA对胃癌SGC-7901、HGC-27细胞迁移的影响

与对照组相比，DHA分别作用24、48 h后，SGC-7901和HGC-27细胞的愈合速度明显变慢（P＜0.05）。结果表明，DHA能明显降低SGC-7901和HGC-27细胞迁移能力，见表1。

表1　DHA对胃癌细胞迁移能力的影响Table 1 Effect of DHA on the migration of gastric cancer cells （s，%）

表1　DHA对胃癌细胞迁移能力的影响Table 1 Effect of DHA on the migration of gastric cancer cells （s，%）

与对照组比较:*P＜0.05。

组别　24 h 48 h SGC-7901　HGC-27SGC-7901　HGC-27对照组　32.09±0.1　25.81±2.1　65.19±2.7　63.61±2.1处理组　17.22±2.2*16.25±1.9*36.78±1.9*32.68±1.5*

3　讨论

DHA是青蒿素类衍生物，被世界卫生组织推选为一线强效治疗恶性疟疾的药物，近年来研究发现，DHA具有抗肿瘤、抗炎、增强免疫力等作用，特别在抗肿瘤的作用中，具有多靶点、多通路、对正常细胞毒副作用小等优点［9-10］，为其临床应用开发奠定了基础。

癌症发生的实质是细胞周期调控的紊乱，使机体细胞无间断的进入细胞周期，失去自主凋亡能力，恶性增殖失控的结果。因此抑制胃癌细胞增殖，并促使细胞凋亡是治疗胃癌的重要方面。本研究提示DHA可以明显抑制胃癌细胞的增殖，且呈浓度依赖性趋势，说明DHA对不同分化程度的胃癌细胞均具有抑制增殖的作用。当DHA浓度为6.25 μmol/L时，中分化SGC-7901细胞的抑制率是44.07%，而低分化HGC-27细胞的抑制率达到了63.64%，提示不同分化程度的胃癌细胞对相同浓度的DHA的敏感度也不同。

相关文献［14-17］表明，Bcl-2基因是一种原癌基因，其参与了胃癌细胞分化的过程，在不同分化程度的胃癌组织中均高表达，且在高分化胃癌组织中的表达明显高于低分化胃癌组织，从而提高了胃癌的发病率。本实验中，DHA可以使胃癌细胞的周期进程阻滞在S期，并且诱导胃癌细胞出现凋亡现象，说明DHA可以通过延长细胞周期并促使细胞发生凋亡的方式，达到减缓细胞增殖的目的。但DHA促使胃癌细胞凋亡的具体作用机制是否与调控Bcl-2蛋白表达有关还需进一步的深入研究。

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（责任编辑：幸建华）

Effect of dihydroartemisinin on the apoptosis of gastric cancer cells

YOU Qi1，ZHANG Huining2，LI Kundong2，ZHANG Jufeng2
（1.School of Traditionnal Chinese Medicine；2.School of Life Science&Biopharmacology，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To investigate the growth inhibitory and apoptosis effects of DHA on gastric cancer cells.Methods The proliferation of gastric cancer cells was detected using WST-1.The cell cycle progression and cell apoptosis were determined by flow cytometry.The cell migration ability was detected by wound-healing assay.Results The different concentrations of DHA inhibited the proliferation of gastric cancer cells（SGC-7901，HGC-27）in a concentration-dependent manner.DHA arrested the cell cycle of gastric cancer cells at S phase and promoted the apoptosis of gastric cancer cells at 48 h.After treatment with DHA for 24 h and 48 h，the metastasis ability of gastric cancer cells were declined.Conclusion DHA can effectively inhibit the proliferation of gastric cancer cells and promote cell apoptosis.

DHA；gastric cancer cells；proliferation；apoptosis

R735.2

A

1006-8783（2016）04-0466-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016050301

2016-05-03

国家自然科学基金项目（81171447）；广东省科技计划项目（2014A020212303）；广东大学生科技创新培育专项资金项目（pdjh2016b0262）

尤琪（1993—），女，2014级中药学专硕研究生；通信作者:张巨峰（1973—），男，教授，硕士生导师，主要从事肿瘤基因治疗和分子标记物筛选的研究，Email:jfzhanglll@163.com。

网络出版时间:2016-07-08 14:52 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160708.1452.003.html