均匀设计法优选巴戟天盐制工艺及盐制前后5种糖含量比较研究

刘飞，肖凤霞，李宇邦，宋小欣，陈康，阚海峰，3，叶燕莹，刘慧（.广东和翔制药有限公司，广东 广州 50385；.广州中医药大学 中药学院，广东 广州50006；3.广东省中医院二沙岛分院，广东广州5005）

均匀设计法优选巴戟天盐制工艺及盐制前后5种糖含量比较研究

刘飞1，肖凤霞2，李宇邦2，宋小欣2，陈康2，阚海峰2，3，叶燕莹1，刘慧2
（1.广东和翔制药有限公司，广东 广州 510385；2.广州中医药大学 中药学院，广东 广州510006；3.广东省中医院二沙岛分院，广东广州510105）

目的优选巴戟天盐制工艺，比较巴戟天盐制前后果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖5种糖质量分数的差异。方法以耐斯糖质量分数为指标，采用均匀设计试验法，优选巴戟天盐制工艺；采用HPLC-ELSD法测定巴戟天盐制前后5种糖的质量分数。结果最佳巴戟天盐制工艺如下:每100 g巴戟天饮片加食盐水120 mL（含食盐2 g），浸润时间为8.5 h，蒸制时间为5.5 h；巴戟天盐制后果糖质量分数显著增加（P＜0.05），蔗糖、耐斯糖、蔗果五糖质量分数均显著减少（P＜0.05）。结论 均匀设计法所得的优化工艺可靠、稳定，可用于巴戟天盐制工艺的优选。

巴戟天；工艺优选；均匀设计法

巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根，味甘、辛，性微温，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，用于阳痿遗精、宫冷不孕、月经不调、风湿痹痛等症。2015年版《中国药典》收载了巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天3种炮制方法［1］，其中盐巴戟天制后专入肾经，温而不燥，以补肾助阳为主，作用缓和，久服多服无伤阴之弊［2］。

近年来，为探索炮制工艺对中药药效物质的影响，学者们开展了巴戟天炮制前后糖类和蒽醌类化合物的变化研究，采用单因素或正交设计试验等方法，从蒽醌类化合物含量或糖类指纹图谱变化等不同角度进行了比较分析［3-6］，证明炮制前后巴戟天中糖类发生了变化，对阐明其炮制机理有较高的参考价值。有研究表明，盐制对耐斯糖等多种寡糖类指纹图谱均有影响［7-9］，但未见同时对巴戟天炮制前后糖类成分含量变化的研究报道。2015年版《中国药典》（四部）0213炮制通则中关于盐巴戟天炮制工艺的加盐水量、浸润时间、蒸制时间等相关参数均未明确。因此，本文参照2015年版《中国药典》将耐斯糖的质量分数选作为炮制工艺的评价指标，采用均匀设计法并结合耐斯糖等5种糖的质量分数变化情况，探讨盐巴戟天蒸制工艺，明确相关工艺参数，对于规范巴戟天的饮片炮制有重要意义。

1　仪器与试药

Waters E2695型高效液相色谱仪（Waters2424蒸发光检测器，Empower3工作站，美国Waters公司）；DHG型鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；XS225A型分析天平（德国 Sartorius公司）；JYC-21ES10-X电磁炉（山东九阳股份有限公司）。

10批巴戟天经广州中医药大学中药学院林励研究员鉴定为茜草科植物巴戟天Morinda Officinalis How.的干燥根，按2015年版《中国药典》要求，除去杂质，去掉木心及须根，切段至4～5 cm，干燥，来源见表1。果糖（美国Amresco公司，批号F20130516）；蔗糖（广东光华化学厂有限公司，批号2CO60717）；耐斯糖、蔗果三糖、蔗果五糖（上海西宝生物有限公司，批号:AWG0714）；食盐（江西中盐新干盐化有限公司，批号:C79328456）；甲醇为色谱纯，水为超纯水。

表1　10批巴戟天饮片的来源信息表Table 1 The source information of 10 batches of M.officinalis samples

2　方法与结果

2.1因素水平设计

根据单因素试验，影响巴戟天耐斯糖质量分数的工艺因素有食盐加水量（含食盐2 g）（X1）、浸润时间（X2）、蒸制时间（X3），每个因素设计6个水平，应用U6（63）均匀设计表安排试验，因素水平见表2。

表2　U6（63）均匀设计试验的因素与水平表Table 2 Factors and levels of U6（63）uniform design

2.2巴戟天盐制工艺

取巴戟天饮片（S9）6份，各100 g，分别加入相应体积的食盐水（含食盐2 g），按规定时间浸润后，置于蒸锅中加热蒸制，达到规定时间后取出，放凉，60℃下干燥5 h，备用。

2.3糖类质量分数测定［1］

2.3.1对照品溶液的制备 分别取果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖对照品适量，精密称定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇-水（体积比3∶97）定容，摇匀，配制成质量浓度分别为2.176、1.030、1.052、1.010、0.670 mg/mL的混合溶液，作为混合对照品溶液。

2.3.2供试品溶液的制备 取巴戟天饮片，粉碎（过三号筛），取0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-水（体积比3∶97）50 mL，称定质量，沸水中加热30 min，取出，冷却，称定质量，用甲醇-水（体积比3∶97）补足减失的质量，摇匀，放置，取上清液滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.3色谱条件 色谱柱:Accusil C18柱（250 mm× 4.6 mm，10 μm）；流动相:甲醇-水（体积比3∶97）；柱温:30℃；流速:0.8 mL/min；进样量:10 μL；漂移管温度:80℃；雾化温度:50℃:N2压力:3.5 MPa；增益:4。分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，分别按上述条件进样测定，色谱图见图1。

图1　混合对照品溶液（A）、巴戟天饮片（B）、盐巴戟天（C）的HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of mixed references（A），M.officinalis（B），salt M.officinalis（C）

2.3.4线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液2、5、10、15、20 μL，按“2.3.1”项下条件进样，测定峰面积，以进样量的自然对数值（X）为横坐标，峰面积的自然对数值（Y）为纵坐标，进行对数线性回归处理，得到回归方程，见表3。

结果表明，果糖进样量在4.35～43.52 μg范围内，蔗糖进样量在2.06～20.60 μg范围内，蔗果三糖进样量在2.10～21.04 μg范围内，耐斯糖进样量在2.02～20.20 μg范围内，蔗果五糖进样量在1.34～13.40 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表3　5种糖类成分的线性回归方程Table 3 Linear regression equations of 5 kinds of saccharides

2.3.5精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，按“2.3.3”项下条件重复进样5次，测定5种寡糖类成分的峰面积，结果表明，果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖峰面积的 RSD值分别为0.96%、1.06%、0.92%、0.90%、0.81%，表明仪器精密度良好。

2.3.6稳定性试验 取巴戟天饮片（S1）约0.5 g，精密称定，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别在0、2、4、8、12、24 h按照“2.3.3”项下色谱条件进样6次，测定峰面积。结果果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖峰面积的RSD值分别为1.12%、1.50%、1.11%、1.44%、1.62%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.7重复性试验 取巴戟天饮片（S1）约0.5 g，精密称定，平行操作5份，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.3”项下色谱条件测定峰面积，结果果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖峰面积的 RSD值分别为 1.10%、1.34%、0.98%、1.51%、1.73%，表明方法重复性良好。

2.3.8加样回收率试验 取已知质量分数（果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖分别为65.80、183.60、65.17、93.85、94.66 mg/g）的S1号样品约0.25 g，共6份，精密称定，分别准确加入新配制的果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖质量浓度分别为3.300、9.550、3.251、4.505、4.216 mg/mL的对照品溶液5 mL，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.3”项下条件进样，测定峰面积，计算回收率。结果见表4。

2.3.9样品测定 取巴戟天粉末（三号筛），约0.5 g，精密称定，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.3”项下色谱条件测定峰面积，采用外标法计算耐斯糖质量分数，结果见表5。

表4　巴戟天中5种糖类成分的加样回收率试验Table 4 Recovery results of 5 saccharides in M.officinalis（n=6）

表5　U6（63）均匀设计试验结果Table 5 Results of U6（63）uniform design

2.4数据分析

采用SPSS 19.0数据处理软件进行多元线性回归分析，以各因素为自变量，耐斯糖质量分数为因变量，得到回归方程Y=7.184+0.011X1+0.238X2-0.952X3，P＜0.05。根据方程，得到巴戟天盐制工艺的影响因素为蒸制时间＞浸润时间＞食盐水量。确定巴戟天最佳盐制工艺为每100 g巴戟天饮片加食盐水120 mL（含食盐2 g），浸润时间为8.5 h，蒸制时间为5.5 h。

2.5验证试验

取巴戟天饮片（S9）100 g，根据以上确定的最佳盐制工艺条件进行验证试验，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.3”项下条件进样，测定峰面积，计算耐斯糖质量分数，结果测得耐斯糖的平均质量分数为5.004%（RSD=0.67%，n=3），与预期值相近，表明该盐制工艺稳定、可靠。

2.6 巴戟天盐制前后5种糖的质量分数测定

取巴戟天饮片（S1～S10）和盐巴戟天（Z1～Z10）各0.5 g，精密称定，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.3”项下条件进样，测定峰面积，计算5种糖的质量分数，结果见表6。

表6　生巴戟天与盐巴戟天中糖类成分测定结果Table 6 The content of saccharides in M.officinalis and salt M.Officinalis　w/%

对表中果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖的质量分数分别使用SPSS19.0数据处理软件进行配对t检验（给定显著性水平α=0.05），结果表明巴戟天盐制后，果糖、蔗糖、耐斯糖、蔗果五糖的成分发生了显著变化（P＜0.05）；炮制前后耐斯糖质量分数均高于2.0%，符合《中国药典》要求。

3　讨论

均匀试验法具有简便、高效的特点，与正交试验法相比，能够大大减少试验次数，结合回归分析，建立的回归方程精确、可靠，运用该方法建立的盐制工艺合理科学，摆脱传统凭经验与火候炮制的主观性，为实际生产提供参考依据。

糖类作为巴戟天的主要活性成分之一，其含量高低对巴戟天盐制前后的药效变化产生重要影响［8］。在前期研究中发现，巴戟天盐制前后，除耐斯糖质量分数外，其他糖类成分也发生了显著变化，因此进一步对巴戟天盐制前后糖类成分变化作比较，以初步探究盐巴戟天炮制机理。巴戟天盐制后专入肾经，温而不燥，以补肾助阳为主，其炮制机理可能与糖类含量变化有一定联系。在本研究中，巴戟天盐制前后糖类质量分数发生了显著变化，盐巴戟天中果糖质量分数显著增大，蔗糖、耐斯糖、蔗果五糖成分的质量分数显著减小，与文献［9-10］结果一致，初步推测在加热蒸制过程中，巴戟天的糖类成分转化为果糖等成分，对缓和巴戟天燥性起到一定作用，为进一步探讨巴戟天盐制机理提供依据。

本研究对巴戟天炮制前后的果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖5种糖进行了比较分析，而在其他研究中亦发现盐制对巴戟天的其他糖类成分、水晶兰苷、蒽醌类等成分质量分数也有影响［5，11-12］，因此，在今后研究中将以此为基础，结合药效学进行系统分析比较，为探讨中药传统炮制机理继续努力。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版一部［M］.北京:中国医药科技出版社，2015:81-82.

［2］陈红，裴占柱，程再兴，等.盐巴戟天与生巴戟天中水晶兰苷含量对比研究［J］.中医学报，2013，28（10）:1504-1505.

［3］王锋，孙君社，胡绍峰，等.巴戟天炮制工艺的优化及有效成分变化分析［J］.中国酿造，2015，34（8）:101-105.

［4］姜永粮，杨丹，张凡，等.巴戟天炮制前后蒽醌类成分含量变化［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（1）:64-69.

［5］李倩，朱水娣，刘硕，等.炮制对巴戟天中蒽醌类成分的影响［J］.中成药，2015，37（6）:1284-1288.

［6］王成永，金传山，吴德玲，等.盐巴戟天炮制工艺改进实验及质量标准研究［J］.安徽中医学院学报，2005，24 （4）:46-47.

［7］陈地灵，帅欧，林励.炮制方法对巴戟天糖类成分影响的研究［J］.中国药房，2012，23（3）:217-220.

［8］肖凤霞，林励.巴戟天补肾壮阳作用的初步研究［J］.食品与药品，2006，8（5）:45-45.

［9］刘晓涵，陈永刚，林励，等.巴戟天蒸制前后糖类成分HPLC指纹图谱的比较研究［J］.中成药，2009，31（9）: 1313-1315.

［10］景海漪，史辑，崔妮，等.巴戟天炮制前后寡糖类成分HPLC-CAD指纹图谱研究［J］.中草药，2014，45（10）: 1412-1417.

［11］陈小华.炮制方法对巴戟天糖类成分的影响［J］.黑龙江医药，2015，28（2）:281-282.

［12］景海漪，史辑，崔妮，等.不同炮制方法对巴戟天中寡糖类成分和水晶兰苷含量的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（17）:20-23.

（责任编辑：陈翔）

The optimization of the salt processing procedure of Morinda officinalis How. by uniform design and the comparison of 5 kinds of saccharides′s content

LIU Fei1，XIAO Fengxia2，LI Yubang2，SONG Xiaoxin2，CHEN Kang2，KAN Haifeng2，3，YE Yanying1，LIU Hui2
（1.Guangdong Hexiang Pharmaceutical Co.，LTD，Guangzhou 510385，China；2.School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；3.Ershadao Section of Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510105，China）

Objective To optimize the processing procedure of salted Morinda officinalis，and to compare the content of saccharides in different process.Methods Nystose as evaluation index，uniform design was used to optimize the processing procedure of salted Morinda officinalis.High performance liquid chromatography was used to determine the content of saccharides in different process.Results The optimal process was as follows:100 g Morinda officinalis How.steamed 5.5 h after 8.5 h infiltrated by 120 mL salt water（with 2 g salt）.The content of fructose was significantly increased（P＜0.05），and the content of sucrose，nystose，1F-fructofuranosylnystose was significantly decreased after processing with salt water（P＜0.05）.Conclusion The optimized technology is reliable and stable to be suitable for the processing procedure of salted Morinda officinalis.

Morinda officinalis How.；process optimization；uniform design

R282.2

A

1006-8783（2016）04-0415-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016050903

2016-05-09

广州市荔湾区科技计划项目（20143116025）

刘飞（1981—），男，本科，制药工程师，主要从事中药饮片生产及质量管理、中药炮制及质量标准研究，Email:6784345@qq.com。

网络出版时间:2016-07-011 14:52 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1452.005.html