山丹黄参多糖对四氯化碳致急性损伤小鼠肝组织Caspase-3和TNF-α表达的影响

贾宗平,袁　静,俞诗源，3*

(1．西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州　730070;2．甘肃政法学院公安技术学院,甘肃兰州　730070;3.西北师范大学学报编辑部,甘肃兰州　730070)



山丹黄参多糖对四氯化碳致急性损伤小鼠肝组织Caspase-3和TNF-α表达的影响

贾宗平1，2,袁静1,俞诗源1，3*

(1．西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州730070;2．甘肃政法学院公安技术学院,甘肃兰州730070;3.西北师范大学学报编辑部,甘肃兰州730070)

为研究山丹黄参多糖对四氯化碳(CCl4)致小鼠急性损伤的影响，对50只小鼠分别灌胃山丹黄参多糖(12.5，25，37.5g·L-1)或等量的生理盐水7d，最后一次灌胃1h后腹腔注射1%的CCl4橄榄油溶液，16h后处死小鼠，用免疫组织化学法检测Caspase-3，TNF-α在肝组织表达的变化，用比色法检测血浆碱性磷酸酶(ALP)和肝组织谷胱甘肽(GSH)活性的变化.结果显示实验对照组肝组织Caspase-3，TNF-α阳性表达均明显增强(P<0.01)，肝组织GSH活力明显降低(P<0.01)，血浆ALP含量显著升高(P<0.01).而丹黄黄参粗多糖各组肝组织Caspase-3，TNF-α的阳性表达明显减少(P<0.01)，肝组织GSH活力显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)，血浆ALP活性明显降低(P<0.01).表明一定剂量的山丹黄参多糖可提高小鼠抗氧化能力，促进新陈代谢，降低Caspase-3，TNF-α的阳性表达，对四氯化碳造成的急性肝组织损伤有一定的保护作用.

山丹黄参多糖；四氯化碳；小鼠；肝脏；Caspase-3；TNF-α

四氯化碳(CCl4)是有机化工、石油化工等生产中常用的溶剂和民用化学品，由于工业废水和生活垃圾的处理滞后，对环境产生了严重污染[1]，直接影响了人们的生活与健康，因此，研究开发对CCl4毒性作用有影响的植物或中草药，对于治理环境污染和维护动物或人体健康具有重要意义.山丹黄参是多年生野生草本植物，具有抗氧化、镇咳、增强免疫等生理功能[2-4].本课题组研究了山丹黄参对CCl4慢性肝损伤的影响[5-6]，但有关山丹黄参对CCl4致急性肝损伤是否有影响、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)和肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor)是否参与肝损伤过程等尚未见报道，本文给小鼠连续灌胃山丹黄参多糖后，再给小鼠注射CCl4橄榄油，通过检测肝组织Caspase-3和TNF-α表达及谷胱甘肽酶活性的变化，分析研究山丹黄参对CCl4致动物急性损伤的影响.

1　材料与方法

1.1实验药品和动物处理

从甘肃省山丹军马场购买山丹黄参，根据文献[5，7]方法冷冻粉碎后用蒸馏水提取山丹黄参多糖，按1∶50的料液比70 ℃水浴，离心，取上清液减压浓缩，再加95%乙醇，离心，弃上清液冷冻干燥，制成12.5，25，37.5g·L-1黄参多糖水溶液.

四氯化碳(CCl4)分析纯，Caspase-3和TNF-α抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)试剂盒(南京建成生物工程研究所).

从兰州大学基础医学院实验动物中心选购昆明小鼠50只(20±2)g，随机分为空白对照组、实验对照组、实验1，2，3组共5个组.实验1，2，3组小鼠分别连续灌胃浓度为12.5，25，37.5g·L-1的山丹黄参多糖7d(每天2次，Am10.00，Pm4.00，每次0.2mL)，空白对照组和实验对照组小鼠灌胃等量的生理盐水.实验第8d实验对照组和实验1，2，3组小鼠分别腹腔注射1%CCl4橄榄油溶液0.2mL，空白对照组腹腔注射等量的生理盐水.注射1%CCl4橄榄油溶液16h后，经眼眶采血、处死，切取部分肝组织块后在-20 ℃下冷冻备用，其余肝组织入15%福尔马林溶液中固定.

1.2肝组织Caspase-3、TNF-α表达的检测

取上述固定的肝组织块，常规石蜡包埋、切片(6μm)、脱蜡至水，按文献[8]方法观察、检测各组小鼠肝组织Caspase-3、TNF-α蛋白阳性表达产物的平均光密度.

1.3肝组织GSH和血浆ALP活性检测

取上述冻存的各组小鼠肝组织0.5g，按文献[5]方法加生理盐水研磨成组织匀浆、冷冻离心后，上清液按试剂盒要求用全自动分光光度计(日本，岛津UV-1800)在420nm波长处检测各组小鼠肝组织GSH活性.上述采集的血液经冷冻离心，取血浆按试剂盒操作要求用全自动分光光度计在520nm波长处检测各组小鼠血浆中ALP的OD值.

1.4数据统计

实验数据用SPSS13.0进行统计分析，结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示.

2　结果

2.1肝组织Caspase-3表达的变化

Caspase-3蛋白在肝细胞浆内表达，阳性表达部位被染成棕黄色(图1).注射CCl4和灌胃山丹黄参多糖后各组小鼠肝组织都有不同程度的Caspase-3蛋白阳性表达，与空白对照组相比，实验对照组小鼠肝组织Caspase-3蛋白的阳性表达极显著增加(P<0.01)，阳性细胞数量多而密集(图1：A，B)，但与实验对照组相比实验1，2，3组Caspase-3蛋白阳性表达显著减少(P<0.05或P<0.01)，且表达量与多糖剂量呈负相关(图1：C-E)(表1).

表1　小鼠肝组织Caspase-3和TNF-α蛋白表达的平均光密度值

注：**P<0.01 与空白对照组比较；#P<0.05，##P<0.01 与实验对照组比较.

图1　小鼠肝组织Caspase-3,TNF-α的表达Fig 1The Caspase-3,TNF-α expression of mice liver tissue

A．空白对照组小鼠肝组织Caspase-3的表达，标尺示25μm(下同)；B．实验对照组小鼠肝组织Caspase-3的表达；C．实验1组小鼠肝组织Caspase-3的表达；D．实验2组小鼠肝组织Caspase-3的表达；E.实验3组小鼠肝组织Caspase-3的表达；F．空白对照组小鼠肝组织TNF-α蛋白的表达；G．实验对照组小鼠肝组织TNF-α蛋白的表达；H．实验1组小鼠肝组织TNF-α蛋白的表达；I．实验2组小鼠肝组织TNF-α蛋白的表达；J．实验3组小鼠肝组织TNF-α蛋白的表达.

A．TheCaspase-3expressionofnaturecontrolgroup，Bar=25μm(Thesamebelow)；B．TheCaspase-3expressionofexperimentalcontrolgroup；C．TheCaspase-3expressionofexperimental1group；D．TheCaspase-3expressionofexperimental2group；E．TheCaspase-3expressionofexperimental3group；F．TheTNF-αexpressionofnaturecontrolgroup；G．TheTNF-αexpressionofexperimentalcontrolgroup；H．TheTNF-αexpressionofexperimental1group；I．TheTNF-αexpressionofexperimental2group；J．TheTNF-αexpressionofexperimental3group.

2.2肝组织TNF-α表达的变化

肿瘤坏死因子TNF-α在肝细胞胞浆内表达，阳性表达呈棕黄色(图1).与空白对照组相比，实验对照组TNF-α蛋白表达极显著增加(P<0.01)，染色较深(图1：F，G)，但与实验对照组相比山丹黄参多糖各组TNF-α蛋白阳性表达细胞减少，差异极显著(P<0.01，图1：H-J，表1).

2.3肝组织GSH活性的变化

各实验组小鼠肝组织GSH活性都有不同程度的变化(表2).实验对照组肝组织GSH活性与空白对照组相比极显著降低(P<0.01)，但与实验对照组相比实验1，2，3组肝组织GSH活性均又升高，差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01).

表2　小鼠肝组织GSH和血浆ALP活性的变化

注：**P<0.01 与空白对照组比较；#P<0.05，##P<0.01 与实验对照组比较.

2.4血浆ALP活性的变化

各实验组小鼠血浆ALP的活性都有不同程度的变化(表2).实验对照组小鼠血浆ALP活性极显著高于空白对照组(P<0.01)，而实验1，2，3组小鼠血浆ALP活性均低于实验对照组(P<0.05或P<0.01).

3　讨论

3.1山丹黄参多糖对CCl4致急性损伤小鼠肝组织Caspase-3表达的影响

细胞凋亡也称程序性细胞死亡(Programmedcelldeath，PCD)，凋亡信号首先活化不同的Caspase起始因子，然后由起始因子激活级联下游的Caspase效应分子，最终由效应分子特异地水解细胞中的一系列底物分子从而导致细胞解体[9].CCl4进入机体后可能通过脂质过氧化等途径激活了Caspase-3蛋白，使Caspase-3蛋白在肝细胞中广泛表达，造成肝细胞的凋亡.研究表明植物多糖具有修复受损细胞等功能，可阻止凋亡蛋白激活信号通路[10]，山丹黄参多糖可能通过清除自由基及减少凋亡前体物质形成等途径，抑制细胞凋亡的级联反应，可以减少Caspase-3蛋白在肝组织中的活化或表达，从而减轻四氯化碳所致的组织损伤和细胞凋亡，表明山丹黄参多糖对肝组织损伤有一定的保护作用.

3.2山丹黄参多糖对CCl4致急性损伤小鼠肝组织TNF-α表达的影响

TNF-α是由巨噬细胞、单核细胞等产生的一种多肽，它对不同的细胞类型有不同的作用，在某些生理条件下是一种重要的介质[11].正常状态下这种多肽在肝组织中不表达或表达甚少，对肝细胞无杀伤作用，并可诱导肝再生.但在肝脏受到损伤或自由基积累过度时，其促进肝细胞再生的作用就会逆转，通过一系列的信号传导途径促使细胞凋亡[12].CCl4在机体中会生成大量自由基，这些自由基会破坏核酸分子的完整性和构型.通过破坏DNA分子上氢键或改变其特殊密码、改变DNA多聚酶特异位点、改变合成DNA模板的结构,使DNA多聚酶发生错误旋转等途径对DNA造成损伤,最终导致肝细胞的凋亡或坏死[13].本研究中在四氯化碳和炎性因子的作用下，实验对照组TNF-α阳性表达比空白对照组显著增多，但灌胃山丹黄参多糖的各组小鼠肝组织TNF-α的表达与实验对照组相比又明显减少，其原因可能与山丹黄参多糖具有抗氧化作用、可提高机体对自由基的清除能力和速度[3]、增强肝细胞的抗氧化能力有关.

3.3山丹黄参多糖对四氯化碳致急性损伤小鼠肝组织GSH活性的影响

自由基是启动脂质过氧化的关健因素，其含量越高则肝损伤程度越严重.GSH可与毒性基团相互结合然后排出体外，防止蛋白质和细胞膜遭受自由基的损伤[14].GSH活力的高低间接反映机体清除氧自由基的能力，因此，测定GSH活力可了解肝细胞受损伤的程度和肝细胞对毒性物质损伤的拮抗作用[15].CCl4进入体内后，经P450酶系代谢产生三氯甲烷自由基并迅速与氧结合为过氧三氯甲烷自由基，从而引起线粒体膜、内质网膜和细胞膜的变性损伤[16]，同时产生大量的羟自由基和氧自由基，这些产物会造成核酸交联错误或无法分裂，干扰细胞能量代谢以及蛋白质分解等[11].本研究中实验对照组小鼠肝组织GSH活性显著下降，说明肝组织受到严重损伤.有文献报道植物多糖可提高组织过氧化氢酶含量，阻断自由基连锁反应[17]，山丹黄参多糖各组肝组织中GSH活力又升高，表明山丹黄参多糖对肝组织有一定的保护作用.

3.4山丹黄参多糖对四氯化碳致急性损伤小鼠血浆ALP活性的影响

碱性磷酸酶(ALP)是一种同源二聚体蛋白，广泛分布于人体肝脏、肠、骨骼、肾等组织，由肝脏向胆外排出，底物特异性很低，可在碱性环境中水解多种磷酸单酯化合物的酶，但需要镁和锰离子为激活剂，是胆汁淤积性肝炎的重要检测指标.胆汁淤积造成的肝损伤是由于内生性胆汁酸的积聚，这种损伤造成肝细胞凋亡的同时还伴随着脂质过氧化反应的发生，相反这种氧化刺激的产生又加剧了胆汁淤积造成的细胞凋亡[18]，山丹黄参含有大量Mg、Mn等机体必须的微量元素，能增强免疫力、加快机体及细胞代谢，减少自由基的沉积[3]，多糖等抗氧化剂能减少肝细胞的凋亡[19]，本研究中实验对照组血浆ALP活性比空白对照组明显升高，山丹黄参多糖各组血浆ALP活性比实验对照组明显下降，表明CCl4造成了明显肝脏损伤和胆汁淤积，而山丹黄参多糖能加快ALP的代谢、减少肝细胞凋亡，减轻内源性胆汁淤积，对CCl4造成的机体肝损伤有一定的保护作用.

[1]郭英，田西昭，张立宝，等．某水源地地下水四氯化碳污染特征分析[J].南水北调与水利科技，2011，3(9)：109.

[2]陈天仁，罗光宏，祖廷勋，等．黄参螺旋藻保健饮料制备工艺的研究[J].食品科学，2004，1(23)：121.

[3]贾磊，聂秀娟，方梅，等．黄参多糖对小鼠骨骼肌自由基代谢及超微结构的影响[J].河北体育学院学报，2010，24(5)：58．

[4]贾磊，聂秀娟，肖雯，等．黄参多糖干预运动小鼠免疫功能的实验研究[J].成都体育学院学报，2010，36(7)：72．

[5]袁静，俞诗源，孟茹，等．山丹黄参多糖对四氯化碳诱导的慢性肝损伤的保护作用[J].解剖学报，2015，45(3)：387．

[6]俞诗源，袁静，孟茹，等．山丹黄参多糖对四氯化碳损伤小鼠肝形态结构和TNF-α表达的影响[J].西北师范大学学报(自然科学版)，2015，51(2)：78.

[7]罗光宏，李金燕，叶生宝，等．黄参多糖提取工艺参数优化[J].食品科学，2013，34(24)：40.

[8]王锦锦，李重阳，俞诗源，等．中药小复方液对麻黄素致损伤中肾SOD、CAT活性及Bax蛋白与TGF-β1表达的影响[J].中国细胞生物学学报,2013，35(7)：943．

[9]MARANIM，TENEVT，HANCOCKD，etal．Identificationofnovelisofo-rmsoftheBH3domainproteinBimwhichdirectlyactivateBaxtotriggerapoptosis[J].Mol Ceil Bio，2002，22(11)：3577．

[10]欧阳建明，彭花．植物多糖对细胞氧化损伤的保护和修复作用[J].暨南大学学报(自然科学版)，2012，33(5)：516．

[11]吴卉，唐薇，孙设宗．镁离子、维生素E对CCl4诱导的肝损伤TNF-α和Caspase-3含量的影响[J].山西医科大学学报，2013，44(5)：329．

[12]张玲，李俊，王建青，等．野菊花总黄酮对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用[J].安徽医科大学学报，2007，42(4)：412．

[13]ARAMG，POTTERJJ，LIUX，etal．Deficiencyofnicotinamideadeninedinucleotidephosphate，reducedformoxidaseenhanceshepatocellularinjurybutattenuatesfibrosisafterchroniccarbontetrachlorideadministration[J].Hepatology,2009，49(3)：911．

[14]姚莹华，刘强，陈育尧，等．丹参多糖对小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(6)：227．

[15]刘伟萍，金国平，陈培波，等．山药水提物对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的改善作用[J].郑州大学学报，2008，43(5)：885．

[16]夏彦玲，李和平，刘伟石，等．鹿茸粉对四氯化碳急性肝损伤小鼠肝脏超微结构的影响[J].东北农业大学学报，2010，41(7)：100．

[17]杨辉，程清州，许斌，等．竹节参多糖抗脑衰老作用的实验研究[J].时珍国医国药，2009，30(6)：2311．

[18]TILGH．Cytokinesandliverdiseases[J].Can J Gastroenterol，2001，15(10)：661．

[19]俞诗源，孟茹，李重阳，等．当归多糖对麻黄素小鼠肝组织抗氧化酶活性和NF-kB，TNF-α表达的影响[J].西北师范大学学报(自然科学版),2015，51(1)：75．

(责任编辑陆泉芳)

The effects of Shandan Sphallerocarpus gracilispolysaccharideonCaspase-3andTNF-αexpressioninlivertissueofacuteinjuryinmicecausedbycarbontetrachloride

JIAZong-ping1,2,YUANJing1,YUShi-yuan1，3

(1.CollegeofLifeScience,NorthwestNormalUniversity，Lanzhou730070，Gansu，China;2.PoliceTechnologyDepartment,GansuPoliticalScienceandLawInstitute，Lanzhou730070，Gansu，China;3．EditoralDepartmentoftheUniversityJournal，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou730070，Gansu，China)

ToinvestigatetheeffectsofSphallerocarpus gracilispolysaccharide(SGP)onacuteinjuryofmicecausedbycarbontetrachloride(CCl4),50micearegavagedwithSGPatdifferentconcentrations(12.5，25，37.5g·L-1)orphysiologicalsalinefor7d,andintraperitonealinjectionof1%CCl4oliveoilsolutionafterthelastgavage1h,themicearekilledafter16h,thechangesofCaspase-3andTNF-αexpressionoflivertissuearedeterminedbyimmunohistochemicalmethod,thechangesofplasmaalkalinephosphatase(ALP)andlivertissueglutathione(GSH)aredeterminedbycolorimetricmethod.TheresultsshowthattheexperimentalgroupoflivertissueCaspase-3andTNF-αexpressionaresignificantlyenhance(P<0.01),theactivityofGSHinlivertissueisdecrease(P<0.01),plasmaALPcontentisincreasesignificantly(P<0.01).AndSGPgroupsoflivertissueCaspase-3andTNF-αexpressionaresignificantlyreduce(P< 0.01),activityofGSHinlivertissueissignificantlyorverysignificantlyincrease(P<0.05orP<0.01),plasmaALPactivityisdecreasesignificantly(P<0.01).ItindicatesthatSGPcanimprovetheantioxidantabilityofmice,promotemetabolism,decreasethepositiveexpressionofCaspase-3andTNF-α,andhasaprotectiveeffectonacuteliverinjurycausedbyCCl4.

ShandanSphallerocarpus gracilispolysaccharide；carbontetrachloride；mice；liver；Caspase-3；TNF-α

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.03.018

2016-01-02;修改稿收到日期:2016-02-25

甘肃省自然科学基金资助项目(1107RJZA141)，兰州市社会发展项目(2013-3-72，2014-1-102)

贾宗平(1982—)，男，甘肃环县人，讲师，硕士.主要研究方向为生物物证技术.

E-mail:jiazongping@126.com

R338.21

A

1001-988Ⅹ(2016)03-0096-05

*通讯联系人，男，教授，博士，博士研究生导师.主要研究方向为组织发生.E-mail：syyu006@nwnu.edu.cn