升清降浊方对MSG肥胖大鼠胰岛素增敏作用的影响*

杜 娟，张德芹，文 静，黄春丽，张青霞，周文龙，刘 花

（天津中医药大学中医药研究院，天津 300193）

Abstract:［Objective］To observe the effects of Huangdi Jixian decoction guided by “reinforcing and reducing，adjustment the balance”method on the FBG and HbA1c in type 2 diabetic rats.［Methods］Sixty male SD rats of clean grade，randomly selected 10 rats as the normal control group，the remaining 50 of given high fat diet add disposable small dose of intraperitoneal injection of STZ add stress to induce rat model of type 2 diabetes mellitus.After the success of modeling，50 rats were randomly divided into model group，western medicine group，Chinese medicine treatment of low，medium and high dose groups，10 rats in each group.All groups were treated 8 weeks，before and after administration of the body weight，the determination of FPG，HbA1c were administered.［Results］Western medicine treatment group，Chinese herbal medicine in high，medium and low dose group rats were improved in general condition after treatment.The weight in the high dosage group of Chinese medicine increased significantly than those in the other four groups（P＜0.05）.The FBG in the western medicine treatment group，Chinese medicine of high，middle dose group were decreased significantly than model group（P＜0.05 or 0.01）.Traditional Chinese medicine of high dose can significantly reduced HbA1c.［Conclusion］Huangdi Jixian decoction can obviously improve the diabetic rats in general condition，significantly reduced blood glucose and HbA1c.
Key words:Type 2 diabetes；Huangdi Jixian decoction；FBG；HbA1c

升清降浊方对MSG肥胖大鼠胰岛素增敏作用的影响*

杜 娟，张德芹，文 静，黄春丽，张青霞，周文龙，刘 花

（天津中医药大学中医药研究院，天津 300193）

［目的］研究升清降浊方（SQJZF）对L-谷氨酸钠（MSG）肥胖大鼠胰岛素增敏作用的影响及其机制研究。［方法］复制MSG肥胖大鼠模型，随机分为模型对照组、阳性药罗格列酮组、阳性药非诺贝特组、SQJZF高剂量组（含生药6 g/kg）、SQJZF中剂量组（含生药3 g/kg）、SQJZF低剂量组（含生药1.5 g/kg），另取正常组大鼠8只。连续给药50 d后，分别检测大鼠血清瘦素和肌糖元含量；实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测药物对MSG大鼠骨骼肌过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）、瘦素（Leptin）、胰岛素受体底物-1（IRS-1）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的基因表达水平。［结果］模型组MSG大鼠肌糖元和血清瘦素含量显著升高（P＜0.01或P＜0.05），相关基因PPAR、Leptin、IRS-1、IRS-2、GLUT4的相对表达显著降低（P＜0.01）；给药50 d后，各给药组肌糖元和血清胰岛素含量均有降低，对相关基因的相对表达均有一定的调节作用。［结论］升清降浊方可能通过激活PPAR受体，调控Leptin基因的表达，增加胰岛素的敏感性。

升清降浊方；MSG肥胖大鼠；胰岛素抵抗

升清降浊方（SQJZF）来源于临床经验方，由桑叶、荷叶、丹参等中药组成，具有升清降浊，化瘀消痞的功效，是治疗糖尿病前期糖脂代谢紊乱的有效方剂。已有实验研究表明，升清降浊方对自发性2型糖尿病模型KK-Ay和实验性2型糖尿病模型小鼠有降低血糖、调节血脂的作用［1-3］，对四氧嘧啶模型大鼠有降低血糖、调节血脂的作用［4］，对高脂血症家兔有降低血脂，提高脂解酶活性的作用［5-6］。有学者研究发现，噻唑烷二酮（TZD）类代表药物罗格列酮主要作用机制是选择性的激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ），不仅能够促进脂肪前体细胞分化为脂肪细胞，同时还能增加脂肪组织对胰岛素的敏感性［7］，加速外周组织对葡萄糖的摄取和利用，并且还能够抑制瘦素（Leptin）的过量表达，从而达到降低血糖，增加胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗的作用［8］。本次实验将通过复制L-谷氨酸钠（MSG）肥胖大鼠，来进行升清降浊方胰岛素增敏作用的机制研究。

1 材料

1.1 实验动物 Wistar孕鼠24只，由天津实验动物中心提供，合格证号SCXK（津）2010-0002。孕鼠单笼饲养于天津中医药大学实验动物中心，屏障环境，温度（22±2）℃，湿度50%～60%。

1.2 饲料 高脂饲料配方为：10%猪油，1.5%胆固醇，0.25%胆盐，10%蔗糖，78.25%基础饲料，由北京诺康源生物科技有限公司提供。

1.3 药物 升清降浊方：棕色干膏粉，出膏率为100g生药含11.11g干膏粉（1g干膏粉的生药含量为9.00 g），批号2010911，由天津中医药大学中医药研究院药学部提供。阳性对照药罗格列酮［葛兰素史克（天津）有限公司，批号10125188］。阳性对照药非诺贝特（Laboratoires Fournire S.A.，批号15135），MSG（美国Sigma-Aldrich，批号BCBF3631V）。

1.4 试剂 Rat leptin RayBio@ELISA Kit（美国Ray-Biotech，Inc公司，批号20120312），肌糖元检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20120103），Trizol试剂（美国Invitrogen公司，批号l15596018），SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（美国Applied Biosystems公司，批号 4367659），High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit试剂盒（美国AppliedBiosystems公司，批号4368814），引物合成（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号201205）。

1.5 实验仪器 ALLEGRA-64R高速离心机（美国Beckman Coulter有限公司），FlexStation3多功能微孔板分析仪（美国Molecular Devices公司），PC-1000 PCR逆转录仪（美国Perkin Elmer仪器公司），7500 Real-Time PCR system实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Applied Biosystems公司）。

2 方法

2.1 模型的建立 取Wistar孕鼠24只，饲养于清洁级动物房。新生鼠于出生第2天起，皮下注射MSG，注射剂量3 g/kg［9］，正常组注射等量生理盐水，每隔1 d注射1次，连续7次。21 d后断乳，MSG组及正常组均按雌雄分笼饲养，正常组给予普通饲料，MSG模型组给予高脂饲料。定期记录体质量，观察体型变化。第8周时，禁食不禁水8 h检测空腹血脂的含量及糖耐量2 h后血糖，以血脂含量和糖耐量2 h血糖高于正常组为成模标准。

2.2 分组给药 筛选成模雄性大鼠48只，采用随机区组法随机分为模型组、罗格列酮组、非诺贝特组、升清降浊方高、中、低剂量组（含生药6、3、1.5 g/kg）6组，每组8只。另取Wstiar雄性大鼠8只为正常组。罗格列酮组给药剂量为5 mg/kg［10］，非诺贝特组给药剂量为100 mg/kg［11］，SQJZF高剂量组给药剂量为含生药6 g/kg，SQJZF中剂量组给药剂量为含生药3 g/kg，SQJZF低剂量组给药剂量为含生药

1.5 g/kg，灌胃体积为10 mL/kg，正常组和模型组灌胃同体积5%阿拉伯胶水溶液。每日上午灌胃1次，连续灌胃50 d。每周称体质量1次，根据体质量调整用药剂量。

2.3 标本采集 给药8周后大鼠禁食（不禁水）8 h，

3.5 %水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血并离心取血清，迅速剖去肝脏和骨骼肌，液氮速冻后一并移入-80℃冰箱冷贮备用。

2.4 检测方法

2.4.1 肌糖元的检测 取骨骼肌组织，生理盐水洗净，滤纸吸干水分，准确称重，加3倍量碱液煮沸20 min，制备组织水解液，采用蒽酮法检测，读取620 nm波长下吸光度（A），计算肌糖元含量。

2.4.2 血清瘦素含量的测定 采用酶联免疫吸附法（ELISA），读取450 nm波长下吸光度（A），计算血清瘦素含量。

2.4.3 实时荧光定量PCR检测基因的表达 骨骼肌组织研磨后，Trizol法提取总RNA，检测RNA样品纯度符合实验要求。每10 μL体系2 000 ng总RNA为模板进行逆转录合成cDNA。逆转录条件：25℃，10 min；37℃，120 min；85℃，5 min，4℃，∞，-20℃保存。取2 μL cDNA进行实时荧光定量PCR，以GAPDH为内参，加入上下游引物各0.5 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，无酶双蒸水补足至总反应体系20 μL，于PCR仪中进行反应。用2-△△CT方法计算各基因的表达水平。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.5 统计方法 采用SPSS 18.0软件，实验数据均以均数±标准差（±s）表示，正态分布计量资料组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），偏态分布组间比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对肌糖元含量的影响 模型组MSG大鼠肌糖元含量与正常组相比显著升高（P＜0.01）；给药50 d后，与模型组相比，各给药组均显著降低MSG大鼠肌糖元含量（P＜0.01）。见表2。

3.2 对血清瘦素的影响 模型组MSG大鼠血清瘦素含量与正常组相比显著升高（P＜0.05）。给药50 d后，与模型组相比，非诺贝特组显著降低血清中瘦素含量（P＜0.05），其他各给药组均降低血清瘦素含量，但差异无统计学意义。见表2。

3.3 对相关基因表达的影响 模型组MSG大鼠骨骼肌相关基因PPARγ、胰岛素受体底物-1（IRS－1）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）和葡萄糖转运蛋白4 （GLUT4）的相对表达量与正常组相比显著降低（P＜0.01），Leptin的相对表达量与正常组相比显著升高（P＜0.01）。给药50 d后，与模型组相比罗格列酮组和SQJZF高、中、低剂量显著升高PPARγ的基因相对表达量（P＜0.01），非诺贝特组和SQJZF高、中、低剂量显著降低Leptin的基因的相对表达量（P＜0.01），罗格列酮组、非诺贝特组和SQJZF中、低剂量均显著升高IRS-1的基因相对表达量（P＜0.01），罗格列酮组和SQJZF高、中、低剂量组显著升高IRS-2的基因相对表达量（P＜0.01或P＜0.05），各给药组均显著升高GLUT4的基因相对表达量（P＜0.01）。见表3。

表2 SQJZF对MSG大鼠肌糖元和血清瘦素的影响（±s）

表2 SQJZF对MSG大鼠肌糖元和血清瘦素的影响（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别正常组模型组罗格列酮组非诺贝特组SQJZF高剂量组SQJZF中剂量组SQJZF低剂量组n 8888888瘦素（μg/L）- 1.85±0.11** 3.56±1.96*- 2.44±0.22 19.00±7.20 5 mg/kg 1.93±0.21** 9.45±5.25 100 mg/kg 1.80±0.13** 3.71±2.17*生药6 g/kg 1.84±0.17** 10.28±5.05生药3 g/kg 1.80±0.12** 10.99±6.80生药1.5 g/kg 2.07±0.19** 12.43±8.44给药剂量 肌糖元含量（mg/g）

4 讨论

大量研究证明，2型糖尿病患者及肥胖症患者体内糖代谢紊乱，伴随糖耐量异常，胰岛素耐量异常，胰岛素抵抗。胰岛素抵抗的首要表现为脂肪酸代谢异常，可促进脂肪沉积，进一步导致胰岛素抵抗［12-13］。其次，脂肪细胞肥大是导致胰岛素抵抗的又一主要因素。脂肪细胞的增大，一方面会降低脂肪组织对外周组织胰岛素的敏感性，另一方面造成了脂肪组织中特异性的脂肪酸结合蛋白（aP2）以及葡萄糖转运体（GLUT4）的结合能力下降，因而造成胰岛素抵抗［14］。此外，脂肪细胞因子紊乱也能够导致胰岛素抵抗，这些细胞因子包括脂联素（Adiponectin）、瘦素（Leptin）、肿瘤坏死因子（TNF-α）。

胰岛素抵抗是机体对胰岛素的反应减退，表现为外周组织尤其是肝脏和肌肉组织对葡萄糖的利用降低，2型糖尿病患者均有不同程度的胰岛素抵抗。瘦素（Leptin）是能量平衡的一种关键因子，主要贮存于密度较低的分泌囊泡中，在调节因子等的作用下以胞吐的形式释放出来。在2型糖尿病患者中，Leptin可能参与血糖平衡的调节。大量研究证明，PPARγ激动剂TZD类药物可以降低 Leptin mRNA及蛋白的表达水平，改善胰岛素所介导的葡萄糖的代谢作用［15］。

IRS蛋白在胞内保持正常的水平和活性是胰岛素发挥正常功能的重要条件。其中在葡萄糖转运的调控中发挥重要作用的是IRS-1与IRS-2［16-17］。IRS表达的不正常可能是导致胰岛素信号转导出现障碍进而引发胰岛素抵抗的机制之一［18］。另外，机体内靶组织GLUT4表达的减少及活性的降低，与胰岛素抵抗的发生有密切关系。研究发现，GLUT4在2型糖尿病患者体内脂肪细胞中的表达明显减少，GLUT4水平下调并明显抑制脂肪细胞GLUT4的转位及对葡萄糖的摄取，表现为胰岛素信号转导减弱并最终导致胰岛素抵抗［19-21］。

本次实验显示，给药50 d后，MSG大鼠血清中瘦素水平和骨骼肌糖元含量都显著降低。骨骼肌中PPARγ基因的表达水平显著升高，并且Leptin表达水平显著降低，IRS-1、IRS-2和GLUT4基因的表达水平均显著升高。升清降浊方可能通过激活PPARγ受体，调控Leptin基因的表达，增加胰岛素的敏感性。并为后期升清降浊方胰岛素增敏作用的研究打下基础。

表3 SQJZF对MSG大鼠骨骼肌相关基因表达的影响（±s）

表3 SQJZF对MSG大鼠骨骼肌相关基因表达的影响（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 给药剂量 PPARγ Leptin IRS-1 IRS-2 GLUT4正常组- 1.01±0.16** 1.08±0.44** 1.09±0.47** 1.02±0.20** 1.00±0.66**模型组- 0.40±0.18 8.52±0.34 0.28±0.02 0.33±0.03 0.76±0.07罗格列酮组 5 mg/kg 1.44±0.30** 2.40±0.39 0.57±0.10** 1.15±0.18** 2.24±0.09**非诺贝特组 100 mg/kg 0.31±0.11 0.33±0.21** 0.64±0.03** 0.34±0.23 1.64±0.08** SQJZF高剂量组 生药6 g/kg 1.04±0.19** 0.88±0.48** 0.21±0.04 1.06±0.33* 2.06±0.09** SQJZF中剂量组 生药3 g/kg 0.82±0.26** 2.12±0.66** 0.51±0.06** 1.60±0.10** 2.15±0.10** SQJZF低剂量组 生药1.5 g/kg 1.41±0.27** 3.38±0.51** 0.87±0.08** 3.81±0.46** 2.82±0.16**

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Effects of shengqing Jiangzhuo prescription to improve the insulin sensitivity of MSG rats

DU Juan，ZHANG De-qin，WEN Jing，HUANG Chun-li，ZHANG Qing-xia，ZHOU Wen-long，LIU Hua
（TCM Research Institute，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

R587.1

A

1673－9043（2016）01－0027-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.01.08

国家自然科学基金资助项目（81173373）。

杜 娟（1987-），女，硕士研究生，从事中药基本理论及临床应用研究。

张德芹，E-mail：deqin123@163.com。

（2015-10-17）