地鳖多糖提取物的体内外抗氧化作用

2016-09-13谢梦蕊邱思奇沈红

中国实验动物学报 2016年4期

关键词：光度自由基提取物

谢梦蕊，邱思奇，沈红

(北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京102206)

地鳖多糖提取物的体内外抗氧化作用

谢梦蕊，邱思奇，沈红*

(北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京102206)

地鳖多糖提取物；自由基；抗氧化酶；小鼠

地鳖(Eupolyphage sinensisWalker，ESW)是我国传统活血化瘀类中药，在众多医药典籍中均有记载。近年来，随着对地鳖化学成分的深入研究，从中分离出蛋白质、糖类、有机酸、生物碱、氨基酸等有机物及多种微量元素[1]。研究表明，地鳖具有溶解血栓、抗凝血、抗肿瘤、促进骨折愈合、调节血脂、抗突变、耐缺氧等十分广泛的药理作用[2]。

自由基参与体内多种病理、生理过程，其平衡的破坏是多种疾病发生的一个重要因素[3]。同时，机体通过超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽等抗氧化物质来清除有害过氧化物、减轻和阻断脂质过氧化反应。由于对多糖的研究越来越深入，且天然抗氧化剂比合成抗氧化剂安全性更高，近年来对多糖抗氧化活性的研究日益增加。

昆虫作为地球上种类最多、数量最大的生物类群[4]，目前对其研究主要集中在甲壳素、蛋白质类等的提取和应用，而对多糖的研究相对不足[5]，有关地鳖多糖抗氧化功能鲜有报道。本研究通过体内外试验研究地鳖多糖提取物体内抗氧化活性，以期为地鳖多糖的深入研究和开发应用提供试验依据，为利用昆虫来源多糖，拓宽昆虫资源利用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

6～8周龄清洁级KM小鼠40只，体重20～22g，购于中国军事医学科学院实验动物中心【SCXK-(军)2012-0004】。无菌手术在北京农学院实验动物示范中心屏障动物实验室进行【SYXK(京)2015-0004】，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

邻二氮菲、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、二硫苏糖醇(DTT)、硫代巴比妥酸(TBA)、抗坏血酸(Vc)等购于美国Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、总蛋白定量试剂盒购于南京建成生物科技有限公司，地鳖多糖提取物由本实验室制备。UV-3紫外可见分光光度计购于上海美普达有限公司。1.2方法

1.2.1实验分组

小鼠随机分成4组，每组10只，不同剂量地鳖多糖提取物(0、40、80、160mg/kg)灌胃给药(根据预实验及参考文献确定)[6～7]，连续灌服20d。

1.2.2地鳖多糖提取物对自由基清除的测定

(1) 分光光度法测定二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)的清除

取1.2mL0.2mmol/LDPPH溶液、2.6mL双蒸水于试管内混匀，加入0.2mL不同浓度地鳖多糖提取物(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL)和1mg/mLVc溶液，混匀后室温静止避光反应30min，测定517nm处吸光度值。根据公式计算清除率(%)=[1-(A1- A2)]/ A0× 100%，A0为未加样品管吸光度值，A1为样品反应管吸光度值，A2为样品本身吸光度值。

取25℃预热的4.9mLPBS溶液 (pH8.2)、40μL25mmol/L邻苯三酚和30μL不同浓度地鳖多糖提取物(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL)于试管内，25℃反应3min，然后迅速向各管滴加50mg/mLDTT50μL，室温静置5min，测定322nm处吸光度值。根据公式计算清除率(%)=[1-(A1- A2)]/ A0× 100%， A0为未加样品管吸光度值，A1为样品反应管吸光度值，A2为样品本身吸光度值。

(3)Fe2+-邻二氮菲氧化法测定羟自由基(·OH)的清除

取1mL0.75mmol/L邻二氮菲、1mL0.75mmol/LFeSO4、2mLpH7.4PBS、1mL不同浓度地鳖多糖提取物(0、1、3、5、7、9mg/mL)于试管内混匀，然后加入1mL0.01%H202，37℃水浴反应60min，测定536nm处吸光度值。根据公式计算清除率(%)=(A3-A2-A1)/(A0-A1) × 100%，A0为未加样品和H202管吸光度值，A1为未加样品管吸光度值，A2为样品本身吸光度值，A3为样品反应管吸光度值。

1.2.3红细胞氧化溶血的测定

取1mL1%红细胞悬液、50μL不同浓度地鳖多糖提取物(0、1、2、4、8、16mg/mL)、50μL100mmol/LH2O2和4mL生理盐水于试管制备样品反应管，37℃水浴反应1h，迅速冷却，2000r/min离心5min，检测415nm处吸光度值。细胞溶血率(%)=A1/ A0× 100%，A0和A1分别为对照和样品反应管吸光度值。

1.2.4小鼠组织中MDA含量和肝线粒体肿胀度的测定

取1mL1%肝、肾组织匀浆液、100μL6mmol/L硫酸亚铁溶液、40μL60mmol/LH2O2及不同浓度地鳖多糖提取物(0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64mg/mL)于试管内，37℃水浴反应1h，加入1mL15%的三氯乙酸终止反应，再加入1mL0.6%硫代巴比妥酸(TBA)置于沸水中显色15min，冷却后检测A532值。计算MDA生成抑制率=(1-A1/ A0)× 100%，A0和A1分别为对照和样品反应管吸光度值。

制备小鼠肝线粒体液，总蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将其调整浓度为0.5mg/mL。取3mL线粒体液(0.5mg/mL)、0.1mmol/LFeSO4溶液50μL、0.1mmol/LVC溶液50μL、2mg/mL地鳖多糖提取物1mL混匀制备样品反应管，测定A520值。

1.2.5抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活力及MDA含量的测定

末次给药24h后小鼠眼眶采血，制备抗凝全血。迅速分离肝肾，用预冷生理盐水冲洗，制成10%组织匀浆备用。根据SOD、CAT、GSH-Px和MDA试剂盒说明，检测组织和血液中SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量。

1.2.6统计分析

实验数据以平均数±标准差表示，采用t检验分析比较各组数据，方差不齐时用t’检验，P<0.05和P<0.01为差异有显著性。

2　结果

2.1地鳖多糖提取物对自由基的清除

结果如图1所示，地鳖多糖组对三种自由基的清除率均低于阳性对照组，地鳖多糖提取物浓度在0.4～2mg/mL范围内随着浓度升高对DPPH·和超氧阴离子自由基的清除率逐渐提高，呈现剂量效应关系，多糖浓度在2mg/mL时，自由基清除率接近阳性对照组；地鳖多糖在9mg/mL时羟自由基清除率达到81.7%，当浓度高于7mg/mL时，清除率上升缓慢趋于平稳。

图1　地鳖多糖提取物对自由基的清除作用Fig.1　Effects of polysaccharide extraction from ESW on free radical scavenging

2.2地鳖多糖提取物抗氧化活性的分析

结果如图2所示，正常对照组体外红细胞溶血率为20.74%，说明正常红细胞有一定程度的溶血，而地鳖多糖组红细胞溶血率高于40%且明显高于正常对照组，地鳖多糖浓度在1～4mg/mL范围内随着浓度提高，红细胞氧化溶血率呈降低趋势，当浓度大于4mg/mL时红细胞溶血率下降趋于平稳。自由基攻击线粒体膜易引起线粒体膜肿胀，吸光度值改变，通过测定吸光度值变化，分析地鳖多糖提取物对线粒体肿胀的影响。结果随着自由基对线粒体作用时间延长，正常组吸光度值稍有下降，肿胀组吸光度值显著降低，地鳖多糖组吸光度值逐渐降低，低于正常对照组但高于肿胀组(图3)。

图2　地鳖多糖提取物对红细胞氧化溶血的影响Fig.2　Effects of polysaccharide extraction from ESW on hemolysis of erythrocytes

图3　地鳖多糖提取物对肝线粒体肿胀的影响Fig.3　Effects of polysaccharide extraction from ESW on liver mitochondria swelling

2.3地鳖多糖提取物对组织脂质过氧化的作用

由图4可知，地鳖多糖提取物浓度在0.04～0.64mg/mL范围内，随着浓度增加，肝肾组织中MDA生成抑制率均呈明显升高趋势，肾中MDA生成抑制率明显高于肝组织(图4A)。与对照组比较，随着地鳖多糖提取物剂量的增加，小鼠肝肾中MDA含量明显降低，肝中MDA含量降低显著且明显高于肾(图4B)。

2.4地鳖多糖提取物对抗氧化酶活力的影响

图4　地鳖多糖提取物对体外(A)和体内(B)小鼠肝肾组织中MDA生成的影响Fig.4　Effects of polysaccharide extraction from ESW on the production of MDA in mouse liver and kidney tissues in vitro (A) and in vivo (B)

与对照组比较，随着地鳖多糖提取物剂量升高，小鼠肝肾中SOD活力逐渐增强，其中高剂量组极显著高于对照组；肝中SOD活力明显高于肾(图5A)。随着地鳖多糖剂量升高，肝中CAT活力逐渐提高；肾CAT活力低中剂量组降低，高剂量组明显高于对照组；组织之间比较，肝中CAT活力最高明显高于肾(图5B)。地鳖多糖组小鼠肝和血液中GSH-Px活力明显高于对照组，且随着地鳖多糖剂量增加GSH-Px活力显著升高(图6)。

3　讨论

MDA是细胞膜不饱和脂肪酸脂质过氧化的终产物，其化学性质极其活泼，易与蛋白质、核酸等反应，其含量常用来表示机体内脂质过氧化水平及细胞的受损程度[12]。红细胞在体外与H2O2反应后也可产生MDA，MDA可使红细胞膜受损，发生溶血；线粒体膜在自由基攻击下极易发生脂质过氧化反应，破坏膜脂的结构，出现线粒体肿胀等异常现象。张德华等[13]研究发现，夏枯草多糖具有防止膜脂质过氧化的作用，减少红细胞溶血和降低MDA的生成。梁俊等[14]研究结果表明，石榴皮多酚能有效抑制体外金属离子诱导的脂质过氧化，并且具有良好的剂量效应关系。本试验结果发现，地鳖多糖提取物能够显著减少红细胞溶血和脂质过氧化产物丙二醛(MDA) 的生成量，显著降低脂质过氧化物产生。

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。图5　地鳖多糖提取物对小鼠肝肾组织中SOD(A)和CAT(B)中活力的影响Note. Compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01.Fig.5　Effects of polysaccharide extraction from ESW on the activity of SOD (A) and CAT (B) in mouse liver and kidney tissues

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。图6　地鳖多糖提取物对小鼠肝(A)和血液(B)中GSH-Px活力的影响Note. Compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01.Fig.6　Effects of polysaccharide extraction from ESW on the activity of GSH-Px in mouse liver (A) and blood (B)

综上所述，地鳖多糖提取物可能是通过提高抗氧化酶活性，清除自由基，抑制脂质过氧化，从而增强机体抗氧化能力，但其抗氧化作用机理仍需探讨。本研究为地鳖多糖抗氧化作用的深入研究提供实验依据，以及为昆虫资源充分利用奠定一定的科学基础。

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Antioxidant effects of polysaccharide extraction from Eupolyphaga sinensisWalker(ESW) in vitroandin vivo