Helq 对干细胞多能性影响的研究

万聪，黄亚萍，汪妹，肖亚梅，赵小阳

(1. 教育部蛋白质化学和鱼类发育生物学重点实验室，湖南师范大学生命科学学院，长沙　410081；2. 发育生物学教研室，南方医科大学基础医学院，广州　510515)



Helq 对干细胞多能性影响的研究

万聪1,2△，黄亚萍1,2△，汪妹1,2，肖亚梅1*，赵小阳2

(1. 教育部蛋白质化学和鱼类发育生物学重点实验室，湖南师范大学生命科学学院，长沙410081；2. 发育生物学教研室，南方医科大学基础医学院，广州510515)

目的探讨Helq缺失是否影响干细胞的多能性。方法利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得Helq敲除的胚胎干细胞。结果免疫荧光染色结果显示敲除Helq后，Oct4及Nanog的表达与对照组相比无明显差异，通过四倍体补偿实验证明胚胎干细胞的多能性不受影响。同时我们利用Helq敲除的胚胎干细胞继续进行体外分化，最终可以得到Day2的上胚层样细胞。通过免疫染色及real-timePCR分析，结果表明Helq敲除的胚胎干细胞分化为上胚层细胞液无明显异常。结论 Helq缺失不影响多能性干细胞的多能性。

Helq；多能性；胚胎干细胞；上胚层样细胞；CRISPR-Cas9

Helq是一种ATP依赖的具有3’-5’方向的DNA解旋酶，最早发现在古细菌和多细胞生物中[1]。已有研究表明Helq主要是修复DNA复制中所产生的链间交错(interstrandcrosslink,ICL)来维持基因组的稳定性，其作用途径与范可尼(Fanconianemia,FA)途径不一致，主要通过与复合体Bcdx2结合来参与修复[2]。当DNA出现ICL时，Helq就会在停滞的DNA复制叉上打开父本链，并重新塑造一条新的滞后链，以便于招募DNA损伤所需要的底物因子或重新开始DNA复制[3]。在哺乳动物中，Helq主要表达在睾丸、卵巢、心脏及骨骼肌等地方[4]。当该基因发生突变后，细胞对丝裂霉素C敏感，细胞内染色单体或染色体出现畸变，DNA损伤反应性激酶(ATR)底物CHK1的磷酸化合物及G2/M期的细胞减少[5]。虽然Helq敲除的小鼠出生符合孟德尔遗传定律，并且能够正常生长。但是，其敲除小鼠会出现生育能力降低及肿瘤发生的现象。在Helq敲除雌鼠中卵巢癌出现的概率会增加2倍，在雄性小鼠中，睾丸内曲细精管中会有10%～20%左右的生殖细胞的缺失[6]。已有的研究报道，范可尼病人来源的体细胞无法通过Yamanaka四因子(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)进行重编程，或利用低氧环境获得范可尼病人体细胞来源的iPSC(inducedpluripotentstemcells)无法获得畸胎瘤，表明DNA的稳定性可能影响人类多能性干细胞的多能性[7,8]。由于Helq通过修复DNA的链间交错来维持基因组的稳定性，其缺失是否也影响多能性干细胞的多能性，目前并不清楚。本文利用基因敲除技术及体外分化体系，研究Helq对胚胎干细胞及胚胎干细胞向上胚层细胞分化过程中的影响，为进一步论证Helq对干细胞多能性的影响提供理论依据。

1　材料与方法

1.1动物

SPF级的ICR小鼠，雄性5只，雌性10只，6～8周龄，体重19～23g，购于北京维通利华实验动物科技有限公司【SCXK(京)2012-0001】，饲养于南方医科大学【SYXK(粤)2011-0074】，室温21～25℃，光照周期12h。自由取食及饮水。所有动物实验均获南方医科大学委员会批准(L2015071)，并按照委员会的指南和规定执行。

1.2试剂

1.2.1N2B27培养液

DMEM/F12，Neurobasal，N2-supplement(100X)，B27-Supplement(50X)，Gluta-MAX(2mmol/L)，streptomycin(0.1mg/mL)，β-mercaptoethanol(0.1mmol/L)，2%BSA，insulin(10mg/mL)。

1.2.2ES培养液

N2B27，LIF(1000U/mL)，PD0325901(0.4μm)，CHIR99021(3μmol/L)。

1.2.3细胞分化培养液

N2B27，1%KSR，bFGF(12ng/mL)，activinA(20ng/mL)。

1.2.4成纤维细胞培养液

DMEM，FBS，GlutaMAX(2mmol/L)，streptomycin(0.1mg/mL)，NEAA(0.1mmol/L)。

1.2.5细胞试剂

0.01%多聚鸟氨酸(PLO)，0.05%及0.25%胰蛋白酶，DMSO，纤粘连蛋白(laminin)，fibronectin，丝裂霉素C，PBS。

1.2.6分子试剂

TRIzol，SYBRGreenReal-timePCRMasterMix-Plus，MicroEluteGenomicDNAKit，Nanog抗体，Oct4 抗体，4%多聚甲醛，2%BSA，Hoechst(H3570)。

1.3方法

1.3.1小鼠饲养层细胞(Feeder)的建立

颈椎脱臼法处死13.5dpc孕鼠，取出胎儿于PBS中清洗。用镊子去除羊膜和胎盘后，将胚胎放置新的含有PBS的皿中，去除头、四肢和内脏，留躯干用剪刀剪碎，加入0.25 %胰酶消化10～15min后，加入含10%FBS的DMEM终止，离心。所收获的细胞培养在10cm培养皿中。待胚胎成纤维细胞长满后加入10μg/mL丝裂霉素C处理2h。吸走上清，用PBS洗3遍，加入0.25% 胰酶消化5min，用含10%FBS的DMEM终止，离心，去上清。用含10%DMSO的90%FBS冻存备用。

1.3.2小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES)的培养及上胚层样细胞(epiblast-likecells,EpiLCs)的分化

将小鼠Feeder铺于3.5cm皿中，用成纤维细胞培养液培养。24h后去上清加入ES细胞培养液，并将小鼠ES细胞种于feeder上。待ES细胞在feeder上传2～3代后，传至预铺有0.01%PLO及laminin(10ng/mL)基质的3.5cm皿中。传3代后，消化ES细胞，将基质换成fibronectin(16.7μg/mL)，培养液换成分化培养液，并以2×105/ 3.5cm皿的密度进行培养，分化36～48h。

1.3.3RNA的提取及反转录

收取分化第2天的(Day2)EpiLCs用TRIzol提取RNA。 取1μgRNA并以Olig-dT为引物反转成cDNA。

1.3.4实时荧光定量RT-PCR

以合成的cDNA为模板，使用SYBRGREENPCRMasterMix试剂盒，对EpiLCs多能性基因、上胚层、原始内胚层及内胚层基因进行表达分析。每次定量分析设三个重复样品。基因引物如表1。

1.3.5免疫荧光染色

在铺有圆形玻璃片的四孔板中接种feeder，次日将ES细胞传于feeder中，培养2～3d。同样将无feeder上的ES细胞消化后，换成分化培养液，接种于铺有基质及圆形玻璃片的四孔板中分化40h。将上述四孔板中的细胞用PBS洗2遍，加入500μL的4%多聚甲醛室温固定30min。PBS洗脱，2%BSA封闭1h。4℃，孵育一抗，过夜。次日用PBS洗三遍后室温避光孵育二抗1h。PBS洗三遍，加入200μL的10μmol/LHoechst(H3570)，20min，吸走多余液体，用抗荧光淬灭剂封片。

1.3.6基因组的提取及鉴定

细胞基因组利用MicroEluteGenomicDNAKit试剂盒提取，送至华大基因测序。

表1　Real-time PCR 引物序列

注：A. Helq的基因位点(黄色区域代表外显子)；B. Helq-/-的测序结果。图1　建立Helq基因敲除胚胎干细胞系Note. A. Gene locus of Helq (the yellow area represents the exon). B. The sequencing result of Helq-/- in embryonic stem cells.Fig.1　Generation of Helq-/- embryonic stem cells

2　结果

2.1建立小鼠Helq敲除(Helq-/-)胚胎干细胞系

通过NCBI网站查找小鼠的Helq基因的序列，在Helq基因的Exon1(翻译起始密码子ATG之后)上设计sgRNA(见图1A)。将构建好的px330-EGFP质粒共转到小鼠的ES细胞中，挑取10个单克隆细胞于4孔板中，利用T7EI实验和Sanger测序鉴定单克隆基因型，得到一个纯合敲除的单克隆，通过序列比对发现两个等位基因分别缺失2bp和8bp碱基,导致阅读框的碱基序列发生移码突变使HELQ蛋白完全被破坏(见图1B)。该克隆通过扩增后建立成稳定的干细胞系。

2.2小鼠ES细胞多能性的鉴定

将WT(wildtype)及Helq-/-的ES细胞系从feeder状态下传至铺有基质的皿里。在无feeder状态下传3代。我们选取了重要的多能性基因Oct4和Nanog，通过免疫荧光染色可知，Helq-/-和WT相比，两者多能性状态并无出现明显差异(图2A)，说明在ES细胞培养阶段，Helq突变不影响Oct4和Nanog的表达。进一步通过将WT和Helq-/-注射到四倍体囊胚中，可以得到存活的个体，表明Helq-/-ES细胞具有发育为整个动物个体的能力(图2B)，以上实验表明Helq对ES细胞多能性状态无影响。

注：A. 小鼠ES细胞免疫染色荧光图，从左至右依次为白光图Oct4、Nanog、及Hoechst；scale bar=100 μm。B. 新生四倍体补偿小鼠；Scale bar=2 mm。图2　小鼠ES细胞多能性的检测 Note. A. Shows the immunostaining of embryonic stem cells. From left to right: Bright-field, Oct4-green, Nanog-red, Hoechst-blue. Scale bar=100 μm; B. 0.5 dpc “all-ES” mouse by tetraploid complementation. Scale bar=2 mm。Fig.2　Pluripotency of Helq-/- embryonic stem cells

2.3ES细胞向EpiLCs的定向分化及鉴定

为了进一步研究胚胎干细胞分化为上胚层细胞过程中是否存在异常，我们继续将ES细胞在体外进行定向分化成EpiLCs。如图3A所示，Day2EpiLCs的细胞状态良好，细胞与细胞之间致密，死细胞较少，形态上与WT组没有明显区别。免疫荧光染色鉴定可知，Oct4与Nanog两个多能性基因的表达在两组中差异不大(图3B)。Real-timePCR分析多能性Oct4、Sox2、Nanog，内胚层(ICM)特异基因(Zfp42、Esrrb)，上胚层基因(Wnt3、Dnmt3b)以及原始内胚层基因(Gata4、Gata6)的表达可以看出，敲除Helq后，与WT相比，各基因之间表达差异不明显(图3C)。以上结果说明Helq对ES细胞体外分化形成EpiLCs基本无影响。

注：A. Day2 EpiLCs白光图片，scale bar=100 μm； B. 免疫荧光染色图，从左至右分别为Hoechst、Oct4及Nanog，scale bar=100 μm；C. 多能性Oct4、Sox2、Nanog，内胚层Zfp42、Esrrb，上胚层基因Wnt3、Dnmt3b以及原始内胚层Gata4、Gata6 的Real-time PCR结果。图3　Day2 EpiLCs多能性检测 Note. A. Bright-field of day2 EpiLCs. Scale bar=50 μm. B. Immunostaining analysis of expression of Oct4 (middle) and Nanog (right) of day2 EpiLCs, DNA labeled by Hoechst (left). Scale bar=50 μm. C. Real time PCR analysis of EpiLCs, from left to right, Oct4/Sox2/Nanog; ICM genes Zfp42/Esrrb; epiblast genes Wnt3/Dnmt3b; primitive endoderm genes Gata4/Gata6.Fig.3　Gene expression of the Day2 epiblast-like cells

3　讨论

在本研究中利用CRISPR-Cas9建立了Helq-/-的ES细胞系，并通过免疫染色及四倍体补偿实验证明Helq-/-不影响ES细胞的多能性。我们将Helq-/-的ES细胞系继续进行体外定向分化，得到Day2的EpiLCs，并且对Day2EpiLCs进行免疫染色及基因表达分析，结果显示，Helq-/-与WT组相比，EpiLCs的基因表达无明显差异。从而表明Helq不影响干细胞的多能性。

根据之前文献报道，采用TELEN及ZFNs的方法，在Helq的1号外显子或11号外显子敲除或插入的方式均能使Helq基因表达提前终止[9,10]。我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在Helq的基因组的1号外显子上一条链上敲除2个碱基，另一条链上敲除8个碱基，使阅读框的碱基序列发生移码突变，使得HELQ蛋白完全被破坏而成功得到Helq纯合敲除的胚胎干细胞系。与之前所用的TALEN与ZFNs相比，CRISPR针对每个基因，只需要构建一个sgRNA，效率较高，序列选择限制较小。利用CRISPR-Cas9能更加快速的获得基因敲除细胞系。

在DNA复制过程中发生损伤，若不进行修复，则会导致多种疾病。常见的修复途径主要是FA信号通路[11]。有研究表明，用FA病人的细胞进行重编程时，影响诱导形成iPSC的效率[12]。Chd1l作为另一种DNA解旋酶，该基因发生突变后，使其不能够结合到Pou5f1, Nanog, 及 Esrrb等基因的位点上，从而影响细胞的多能性[13]。本研究中通过对Helq-/-ES细胞进行多能性分析，结果表明Helq不影响ES细胞的多能性，其具体机制还有待于进一步研究。

已有研究报道，Helq影响生殖细胞的发育。当该基因发生突变后，导致男性出现少精的症状，而在女性当中则由于发生卵巢癌而导致不孕[6]。由此可知Helq对生殖细胞的发育具有重要的作用。2011年Saitou等[14]能够通过干细胞体外分化获得原始生殖细胞样细胞(Primordialgermcell-likecells,PGCLCs)。我们的研究结果得出Helq敲除的小鼠胚胎干细胞可以分化得到上胚层样细胞，不影响ES细胞向EpiLCs的分化，为后续研究Helq在PGCLC分化中的作用奠定了基础，也对未来研究Helq对人类不孕不育的影响提供借鉴。

[1]BoydJB,SakaguchiK,HarrisPV.Mus308mutantsofDrosophilaexhibithypersensitivitytoDNAcross-linkingagentsandaredefectiveinadeoxyribonuclease[J].Genetics, 1990, 125(4): 813-819.

[2]MuzziniDM1,PlevaniP,BoultonSJ,etal.CaenorhabditiselegansPOLQ-1andHEL-308functionintwodistinctDNAinterstrandcross-linkrepairpathways[J].DNARepair, 2008, 7(6): 941-950.

[3]TafelAA,WuL,McHughPJ.HumanHEL308localizestodamagedreplicationforksandunwindslaggingstrandstructures[J].BiolChem, 2 011, 286(18): 15832-15840.

[4]MariniF,KimN,SchuffertA,etal.POLN,anuclearPolAfamilyDNApolymerasehomologoustotheDNAcross-linksensitivityproteinMus308 [J].JBiolChem, 2003, 278(34): 32014-32019.

[5]TakataK,RehS,TomidaJ,etal.HumanDNAhelicaseHELQparticipatesinDNAinterstrandcrosslinktolerancewithATRandRAD51paralogs[J].NatCommun, 2013, 4: 2338.

[6]AdelmanCA,LoloRL,BirkbakNJ,etal.HELQpromotesRAD51paralogue-dependentrepairtoavertgermcelllossandtumorigenesis[J].Nature, 2013, 502(7471): 381-384.

[7]MüllerLU,MilsomMD,HarrisCE,etal.OvercomingreprogrammingresistanceofFanconianemiacells[J].Blood, 2012, 119(23): 5449-5457.

[8]YungSK,TilgnerK,LedranMH,etal.Briefreport:HumanpluripotentstemcellmodelsofFanconianemiadeficiencyrevealanimportantroleforFanconianemiaproteinsincellularreprogrammingandsurvivalofhematopoieticprogenitors[J].StemCell, 2013, 31(5): 1022-1029.

[9]LuebbenSW,KawabataT,AkreMK,etal.HelqactsinparalleltoFancctosuppressreplication-associatedgenomeinstability[J].NucleicAcidsRes, 2013, 41(22): 10283-10297.

[10]YousefzadehMJ,WoodRD.DNApolymerasePOLQandcellulardefenseagainstDNAdamage[J].DNARepair(Amst), 2013, 12(1): 1-9.

[11]KimH,D’AndreaAD.RegulationofDNAcross-linkrepairbytheFanconianemia/BRCApathway[J].GenesDev, 2012, 26: 1393-1408.

[12]ChlonTM,HoskinsEE,MayhewCN,etal.High-riskhumanpapillomavirusE6proteinpromotesreprogrammingofFanconianemiapatientcellsthroughrepressionofp53butdoesnotallowforsustainedgrowthofinducedpluripotentstemcells[J].JVirol, 2014, 88(19): 11315-11326.

[13]JiangBH,ChenWY,LIHY,etal.CHD1LregulatedPARP1-drivenpluripotencyandchromatinremodelingduringtheearly-stagecellreprogramming[J].StemCell, 2015, 33: 2961-2972.

[14]HayashiK,OhtaH,SaitouM.Reconstitutionofthemousegermcellspecificationpathwayinculturebypluripotentstemcells[J].Cell, 2011, 146:519-532.

Exploration of the effect of Helq gene on stem cell pluripotency

WANCong1,2△,HUANGYa-ping1,2△,WANGMei1,2,XIAOYa-mei1*,ZHAOXiao-yang2

(1.KeyLabofProteinChemistryandDevelopmentalBiologyofMinistryofEducation,CollegeofLifeSciences,HunanNormalUniversity,Changsha410081,China; 2.DepartmentofDevelopmentalBiology,SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515)

ObjectiveToexplorewhetherHelqdeletionaffectthepluripotencyofstemcells.MethodsHelqknockoutembryonicstemcellswereobtainedbyCRISPR-Cas9geneeditingtechnique.ResultsTheresultsofimmunofluorescenceanalysisshowedthattheexpressionofOct4andNanoghadnoobviousdifferencetothatofthecontrolcells.TheHelq-/-embryonicstemcellscouldproduceviablepupsbytetraploidcomplementation,indicatingthattheirpluripotencywasnotaffected.Meanwhile,wefoundthatday2epiblast-likecellsalsowereobtainedthroughdifferentiationoftheHelq-/-embryonicstemcellsin vitro.Immunostainingandreal-timePCRanalysisshowedthatthegeneexpressionofHelq-/-epiblastcellsweresimilartothewildtypecells.ConclusionsTakentogether,itisprovedthatthegenomicinstabilitycausedbyHelqdeletiondoesnotaffectthepluripotencyofpluripotentstemcells.

Helq;Pluripotency;Embryonicstemcells;Epiblast-likecells;CRISPR-Cas9

XIAOYa-mei.E-mail:yameix@126.com

国家自然科学基金(编号：31322036)；湖南省研究生科研创新项目(编号：CX2014B228)。

万聪(1990-)，女，硕士研究生，专业：细胞生物学。Email:congw900822@163.com。△黄亚萍为并列第一作者。

肖亚梅(1968-)，女，教授，研究方向：动物生殖发育及分子调控机制。Email:yameix@126.com

研究报告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0358-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.005

2016-01-13