探讨FCST在妇女阴道分泌物分离的白色念珠菌药物敏感性检测中的应用

李爱娟 吴宗宝 张传飞 周永列★ 胡庆丰 吕火烊

探讨FCST在妇女阴道分泌物分离的白色念珠菌药物敏感性检测中的应用

李爱娟 吴宗宝 张传飞 周永列★ 胡庆丰 吕火烊

目的 了解本地区阴道炎妇女念珠菌感染情况及流式细胞术药物敏感试验（FCST）检测念珠菌对常用唑类抗真菌药物敏感性的可行性。方法 对2864例阴道炎妇女的阴道分泌物进行念珠菌的分离培养鉴定，FCST检测分离的白色念珠菌对氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC）的药物敏感性并与细菌自动鉴定及药敏仪（ATB）检测结果进行比较。结果 2864份阴道分泌物分离念珠菌344株，阳性率为11.9%，白色念珠菌285株占82.8%。白色念珠菌对FCA耐药性较低为3.2%，对VRC和ITR的耐药率均＞30%。ATB-F与FCST检测285株白色念珠菌对FCA、VRC、ITR的符合率分别为95.1%、88.1%和91.2%。结论 白色念珠菌是本地区农村妇女阴道分泌物的主要病原菌，本地区阴道分泌物分离白色念珠菌对VRC和ITR有一定的耐药性。与ATB真菌药敏试验（ATB-F）比较FCST用于检测真菌对药物的敏感性或耐药性具有快速、准确、敏感等优点，具有临床应用前景。

流式细胞术 药物敏感试验 白色念珠菌 氟康唑 伏立康唑 伊曲康唑

阴道炎是妇女最常见的妇科疾病之一，念珠菌是妇女外阴道感染主要病原体之一［1］。念珠菌属是一类条件致病菌，又名假丝酵母菌（Candida），属内包括150多个种，主要以白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌等为主［2］。目前实验室检测念珠菌对抗真菌药物的药物敏感性常用微量稀释法、纸片扩散法。国内外已有报道基于流式细胞术快速检测临床分离细菌的药物敏感性的流式细胞术药物敏感试验（FCST），具有快速、准确、结果清晰、易于标准化等优点。为了解本地区阴道炎妇女念珠菌感染情况及对FCST检测念珠菌对常用唑类抗真菌药物敏感性的可行性，作者对2864例阴道炎妇女的阴道分泌物进行念珠菌的分离培养鉴定，FCST检测分离到的白色念珠菌对氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC）的药物敏感性并与细菌自动鉴定及药敏仪（ATB）检测结果进行比较，现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 采集2014年1月至2015年7月来本院妇科和皮肤性病科门诊的2864份女性就诊者阴道分泌物，年龄20～63岁，平均（34±8）岁。临床上有外阴不适、瘙痒、白带增多、异味，小便不适等；2周内未服任何抗生素及局部未用外用药。

1.2 试剂及仪器 念珠菌显色培养基购自郑州安图绿科生物工程有限公司。FCA、ITR和VRC分别由法国辉瑞公司、比利时杨森公司和爱尔兰辉瑞公司生产。碘化丙啶购自Sigma，RPMI-1640培养液购自北京海克隆。流式细胞仪为美国BD FACSCalibur，ATB 自动细菌鉴定仪/FUNGUS试纸条为法国梅里埃产品。

1.3 方法 （1）菌株培养与鉴定：标本采集用一次性无菌阴道窥器，扩张阴道，用消毒棉签取后穹窿分泌物。将分泌物拭子接种于念珠菌显色培养基，35℃恒温箱培养24～72h，呈淡绿色为白色念珠菌，蓝灰色或铁蓝色为热带念珠菌，紫色为克柔念珠菌株，奶油色至白色为光滑念珠菌株。挑取初步鉴定为白色念珠菌菌落用无菌蒸馏水稀释成相当于2号麦氏管的菌悬液，加250μl稀释液至C培养基，混匀取135μl菌悬液于真菌鉴定条，ATB读取结果。（2）ATB真菌药敏试验（ATB-F）：无菌接种环挑取1～3个ATB 自动细菌鉴定仪鉴定为白色念珠菌菌落用无菌蒸馏水制备相当于2号麦氏管的菌悬液，吸取20 μl 稀释液至ATB-F混匀，分别加135μl菌悬液于含ATB药敏条（法国生物梅里埃公司）的各微孔，无菌矿物油封存后35℃恒温箱培养24～72h后根据试剂使用说明书提供的判读标准判读结果。（3）流式细胞术药敏试验（FCST）：参考文献［3］，各白色念珠菌临床菌株悬液用RPMI-1640培养液稀释至1×106/ml。取1ml菌液中分别加入不同终浓度的各抗真菌药物，加入药物与浓度见表1。另设1份无药阴性对照和1份加热处死的阳性对照。35℃孵育3h。3000r/min 离心5min，取白色念珠菌沉淀加入脱氧胆酸钠（SDC）溶液20μl，混匀后室温放置5min。加入浓度为50μg/ml的PI 染液200μl，室温下染色15min后，加入25 mmol/L 的去氧胆酸钠20μl后染色5～10min后在流式细胞仪上检测。流式细胞术分析的门设定和微量稀释最小抑菌浓度（MICS）判定参考文献［4］。

2 结果

2.1 念珠菌分离情况 2864份阴道分泌物念珠菌显色培养阳性344份，无不同念珠菌重叠感染，阳性率为11.9%。其中白色念珠菌285株占82.8%，光滑念珠菌24株占7.0%，热带念珠菌22株占6.4%，克柔念珠菌11株占3.2%，星形念珠菌2占0.6%。

2.2 药敏试验结果 285株白色念珠菌对3种唑类抗菌素真菌药物的MICs见表1。

表1 药敏试验药物终浓度及白色念珠菌临床菌株的MICs

2.3 两种药敏试验比较 285株白色念珠菌分别用ATB-F和FCST检测对3种唑类抗菌素真菌药物的敏感性。ATB-F检测285株白色念珠菌对FCA、VRC、ITR的耐药性分别为3.2%、31.9%和27.7%；用FCST检测285株白色念珠菌对FCA、VRC、ITR的耐药性分别为3.2%、31.2%和31.2%。ATB-F与FCST检测285株白色念珠菌对FCA、VRC、ITR的符合率分别为95.1%、88.1%和91.2%。

3 讨论

念珠菌性阴道炎的发病机制与多种因素有关，如长期服用广谱抗生素、口服避孕药和激素、免疫抑制剂等因素诱发感染［5］。国外报道约40%～70%的成年妇女有外阴阴道念珠菌病病史，约5%患者有反复发作，反复发作和顽固难愈与念珠菌的耐药性密切相关。致病菌种类的分析和药物敏感性的监测对临床有着重要意义。近年国内也见临床病例中真菌、尤其是念珠菌的感染率日趋升高且对一线抗真菌药物FCA和VRC耐药性不断增强［2］。本资料中，2864份女性就诊者阴道分泌物念珠菌感染率为11.9%，白色念珠菌占82.8%。白色念珠菌对3种唑类抗真菌药物除对FCA较敏感（耐药率为3.2%）外，对其余2种药物的耐药率均＞30%，提示对引起阴道炎的真菌应该加强药敏检测，防止滥用药物和非规范化自行使用药物。

美国国家临床实验室标准化委员会（CLSI）推荐的真菌药敏试验方法主要有常量稀释法、微量稀释法、纸片扩散法［3］。本实验室真菌药敏试验常用纸片扩散法，与稀释法比纸片扩散法较为简便，但培养周期长、易污染、有拖尾现象等缺点存在；近年有实验室使用的E-test检测真菌药物敏感性，虽简便，但仍需较长实验时间且主观因素易影响结果判断［6］。因此，建立快速、准确、易于标准化的真菌药敏试验方法具有重要的临床意义。

本资料中，作者从阴道炎妇女阴道分泌物中分离到的285株白色念珠菌，用文献建立的FCST检测了对FCA、ITR和VRC的敏感性并与ATB-F法进行比较，ATB-F与FCST检测285株白色念珠菌对3种唑类抗真菌药物符合率较高均在90%左右，对ITR的符合率高达95.1%，提示FCST与ATB-F测定白色念珠菌的药物敏感性有较好的一致性。FCST检测白色念珠菌对抗真菌药物药敏试验可在0.5 h内出结果，而用稀释法、微量稀释法、纸片扩散法需＞2d时间。当然目前使用的FCST检测白色念珠菌方法与参数参考文献获得，虽然结果表明文献方法适用于本实验室，但要在更多种类的真菌甚至其他细菌使用流式细胞术检测其药物敏感性还有待于条件的进一步摸索以利于建立标准化程序。

1 Nenadić D，Pavlović MD.Value of bacterial culture of vaginal swabs in diagnosis of vaginal infections. ojnosanit Pregl，2015，72（6）：523～528.

2 Shi XY，Yang YP，Zhang Y，et al.Molecular identification and antifungal susceptibility of 186 Candida isolates from vulvovaginal candidiasis in southern China.J Med Microbiol， 2015，64（Pt 4）：390～393.

3 Zhou X，Brown CJ，Abdo Z，et al.Differences in the composition of vaginal microbial communities found in healthy Caucasian and black women.ISME J， 2007，1（2）：121～133.

4 Lanchares JL，Hemandez ml.Recurrent vaginal candidiasis changes in etiopathogenical patterns.Int J Gynaecol Obstet，2000，71（Supple 1）：S29～35.

5 Arikan S.Current status of antifungal susceptibility testing methods.Med Mycol， 2007，45（7）：569～587.

6 赵心懋，徐英春，段琼，等.氟康唑体外抗菌活性及五种体外敏感试验方法的比较.中华检验医学杂志，2006，29（2）：128～132.

317200 浙江省人民医院天台分院（李爱娟 吴宗宝张传飞）

310014 浙江省人民医院（周永列 胡庆丰 吕火烊）