PCR在自发性腹膜炎快速诊断中的应用

喻长法 叶丽君 章灵敏 段达荣 徐黔宁

PCR在自发性腹膜炎快速诊断中的应用

喻长法 叶丽君 章灵敏 段达荣 徐黔宁

目的 探讨聚合酶链式反应（PCR）在自发性腹膜炎快速诊断中的应用价值。方法 针对原核微生物16S rRNA基因的高度保守性，设计合成所有细菌、革兰阴性菌（G-）和革兰阳性菌（G+）的通用引物，用PCR扩增已知的病原菌，检测其特异性。用此方法扩增自发性腹膜炎患者的腹水标本，将结果与培养法进行对比分析。结果 通用引物扩增后，已知病原菌均获得371bp产物。G-菌通用引物扩增后，G-菌均获得252bp产物，G+菌无相应产物；G+菌通用引物扩增后，G+菌均获得202bp产物，G-菌无相应产物。PCR方法的阳性率显著高于培养法（P＜0.05）。结论 PCR检测细菌16S rRNA基因，具有检测速度快、敏感性高和结果准确等优点，具有一定的实用价值。

自发性腹膜炎 16S rRNA基因 聚合酶链反应

自发性腹膜炎（SBP）是腹腔内及邻近器官在无需外科处理的细菌感染来源情况下发生的细菌性腹膜炎，是失代偿期肝硬化伴腹水患者常见的并发症［1］。至今为止，SBP的确诊主要依赖于腹水培养及腹水常规检查，但培养阳性率低，耗时长，不能满足临床需求。本研究将聚合酶链式反应（PCR）技术应用于腹水细菌的快速检测，取得了较好的效果，现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2012年1月至2014年6月本院感染科和消化内科收治的肝硬化失代偿期伴腹水的住院患者共73例，其中男39例，女34例；年龄31～82岁，平均年龄（54.0±13.5）岁。其诊断标准参照2000年西安全国传染病与寄生虫病会议制订的标准［2］。

1.2 临床标本的采集 无菌条件下抽取患者腹水30ml，10ml用于细菌需氧和厌氧培养，10ml用于腹水生化和常规检查，10ml用于PCR检测。

1.3 已知实验菌株的来源 已知菌株为本院检验科微生物室保存的菌株，人类基因组DNA、巨细胞病毒、白色假丝酵母菌由省临床检验中心提供。

1.4 仪器与试剂 9600型PCR反应仪由美国Perkin elmer公司提供，DYY-III型稳压稳流电泳仪由北京六一仪器厂提供，Gel doc l000型凝胶图像处理系统由美国BIO-RAD公司提供。PCR试剂盒由大连宝生物公司提供。

1.5 方法 （1）引物设计：所有细菌通用引物为：上游5'-TGCGGTTGGATCACCTCCT-3'，下游5'-TCCCCACCTTCCTCCAGTT-3'。革兰阴性菌（G-）引物：上游5'-GCATCAGGTCAAGTCATC-3'，下游5'-CCCGGCTTCGTATTCACC-3'。革兰阳性菌（G+）引物：上游5'-GCATCAGGTCAAGTCATC-3'，下游5'-GGCTTCTGCTGTTACAAA-3'。（2）反应体系和反应条件：PCR反应体系为：2.5mmol/L dNTPs 4μl，25 mmol/L MgCl24μl，10×Buffer 5μl，20μmol/L引物各1μl，5U/μl Taq酶0.25μl，模板5.0μl，加无菌双蒸馏水至50μl。反应条件为：94℃预变性6 min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃ 2min共循环30次，最后延伸10min。（3）基因产物分析：将PCR扩增产物2μl与1μl上样缓充液充分混匀后，加样于1.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭），经100 V电压电泳30min，将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶图像分析仪上，紫外线透射扫描观察并拍照保存。

1.6 统计学分析 采用SPSS16.0统计软件。两方法阳性率比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细菌通用引物的特异性分析 已知细菌16S rRNA基因经PCR扩增后均有371 bp的产物，而人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌无对应产物，见图1。

2.2 G-菌通用引物扩增结果 G-菌经其通用引物扩增后，均获得252bp产物，而G+菌无相应产物，见图2。

图1 已知病原菌PCR扩增后产物电泳图

图2 革兰阴性菌通用引物扩增后产物电泳图

2.3 G+菌通用引物扩增结果 G+菌经其通用引物扩增后，均获得202bp产物，而G-菌无相应产物，见图3。

图3 革兰阳性菌通用引物扩增后产物电泳图

2.4 临床标本两方法阳性率的比较 培养法检测11例阳性，PCR方法检测25例阳性，PCR方法阳性率显著高于培养法（P＜0.05），见表1。

表1 两种方法敏感性比较

2.5 临床标本两方法检测结果比较 培养法7株G-菌，4株G+菌，PCR分型与其一致。另PCR方法分型9株G-，5株G+，培养法为阴性结果。

3 讨论

SBP是肝硬化腹腔积液常见的严重并发症，发生率可达10%～25%，病死率高达50%，而早期临床表现不典型，快速诊断和积极治疗是挽救患者生命的关键［3］。

16S rRNA基因序列具有总长度适宜、多信息和多拷贝等特点，存在于所有原核微生物基因组中，故在细菌学研究中常被作为研究的靶分子，用于病原微生物的快速鉴定。借助于16S rRNA基因的保守区，可设计出多条引物，用于细菌感染性疾病的快速诊断。冯群灿等［4］将16S rRNA基因检测应用于慢性非细菌性前列腺炎患者的前列腺液，扩增出1032bp的产物，16S rRNA基因检测阳性率为38.5%，说明在慢性非细菌性前列腺炎的前列腺液中，仍有许多病原菌存在的可能。张芳等［5］设计一条通用引物，用于新生儿脓毒症早期诊断，PCR检测细菌DNA均得到预期的约371 bp大小的扩增产物。陈群伟等［6］研究抗生素应用对16S rRNA基因芯片检测腹水细菌的影响，患者使用抗生素后，培养法阳性率明显降低，而16S rRNA基因芯片几乎不受影响且阳性率显著高于培养法。潘红英等［7］应用定量PCR联合基因芯片检测腹水细菌16 SrRNA诊断自发性细菌性腹膜炎，定量PCR联合基因芯片检测阳性率为22.4%，其中G-菌9份，G+菌8份；腹水细菌培养阳性率为7.9%，均为G-菌，两种方法差异有统计学意义（P＜0.05）。汤伟等［8］用半巢式PCR检测细菌并革兰分型，半巢式PCR阳性率显著高于培养法，革兰分型与培养法吻合度高。

本研究采用细菌通用引物扩增已知病原菌，均获得371bp扩增产物，G-菌通用引物扩增后，G-菌均获得252bp产物，G+菌无相应产物；G+菌通用引物扩增后，G+菌均获得202bp产物，G-菌无相应产物，证实细菌通用引物、G-菌和G+菌的通用引物具有特异性。培养法阳性率为15.07%，PCR方法阳性率为34.25%，PCR方法阳性率显著高于培养法（P＜0.05）。对两种方法革兰分型对比分析可知，培养法7株G-菌，4株G+菌，PCR分型与其一致，另PCR方法分型9株G-，5 株G+，培养法为阴性结果，证明PCR分型结果可靠。

总之，16S rRNA基因应用于SBP患者腹水细菌检测，具有检测速度快、特异性高等特点，并能将病原菌进行初步分型，指导SBP抗生素的选择方面可能有重要的应用价值，尤其是对腹水培养阴性的临床感染患者，显著优于腹水培养方法，可以提高SBP的确诊率，有利于临床及时诊断和治疗。

1 Runyon BA.Practice Guidelines Committee，American Association for the study Liver Disease （AASLD）.Management of adult patients with ascites due to cirrhosis .Hepatology，2009，49（6）：2087～2107.

2 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.传染病信息，2000，13（4）：141～142.

3 陈银芸，霍继荣.乙型肝炎肝硬化并发腹膜炎患者血清及腹腔积液TNF-α、IL-8、IL-18水平临床意义的探讨.中国当代医药，2010，17（14）：32～34.

4 冯群灿，戎永楚. 16S rRNA基因检测在慢性非细菌性前列腺炎患者中的应用 .现代实用医学，2013，25（5）：574～576.

5 张芳，宋力，党力亨，等.基因检测在新生儿脓毒症早期诊断中的价值.实用儿科临床杂志，2011，26（10）：764～766.

6 陈群伟，潘宏仪，孙洪运，等.抗生素应用对16S rRNA基因芯片检测腹水细菌的影响 .国际流行病学传染病学杂志，2012，39（2）：92～94.

7 潘红英，谌翠容，尚世强，等.定量PCR联合基因芯片检测腹水细菌16SrRNA诊断自发性细菌性腹膜炎.中华肝脏病杂志，2011，19（4）：297～300.

8 汤伟，汪晓莺，马国光，等.快速检测细菌并革兰分型的半巢式聚合酶链反应及其初步应用 .中国人兽共患病杂志，2005，21（2）：164～168 .

Objective To explore the application value of PCR in rapid diagnosis spontaneous peritonitis. Methods PCR primers of all bacteria，gram-negative and gram-positive were synthesized according to the high conservative region of 16S rRNA gene in bacteria.，the known pathogens were amplified by PCR to test its specificity.Ascites samples were tested by PCR，and PCR results were compared with culture method. Results The known pathogens obtained 371 bp product after general primer amplification.Gram-negative bacteria obtained 252 bp product after gramnegative bacteria general primer amplification，while gram-positive bacteria without corresponding product. Gram-positive bacteria obtained 202 bp product after gram-positive bacteria general primer amplification，while gram- negative bacteria without corresponding product. The positive rate of PCR method was significantly higher than that of culture method（P＜0.05）. Conclusion PCR technology has advantages of short detection time，high sensitivity and accurate in identifying 16S rRNA gene of bacteria.

Spontaneous bacterial peritonitis（SBP） 16S rRNA gene Polymerase chain reaction（PCR）

·临床研究·

浙江省台州市黄岩区科技局资助项目（201305926）

318020 浙江省台州市第一人民医院