离子阱液质联用仪应用于植物叶片游离氨基酸快速分析方法的建立

张战凤,李红霞,樊永亮,宋　月,武丽娟,田宏刚,刘小凤,刘同先

(1.西北农林科技大学 植物保护学院，农业部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室，旱区作物逆境生物学国家重点实验室， 陕西杨凌　712100； 2.西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌　712100)



离子阱液质联用仪应用于植物叶片游离氨基酸快速分析方法的建立

张战凤1,李红霞2,樊永亮1,宋月1,武丽娟1,田宏刚1,刘小凤1,刘同先1

(1.西北农林科技大学 植物保护学院，农业部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室，旱区作物逆境生物学国家重点实验室， 陕西杨凌712100； 2.西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌712100)

建立一种液相色谱-离子阱串联质谱(LC-MS-MS) 同时分析植物组织中23 种游离氨基酸的方法。植物样品经盐酸-乙醇法一步提取后直接进样，无需进行衍生和固相萃取等其他前处理步骤。液相色谱采用Intertsil OSD-4 C18(250 mm ×3.0 mm )色谱柱，采用甲醇-甲酸体系进行洗脱，对23种氨基酸获得比较理想的分离效果。结果表明，该方法通用性良好、样品制备简单(一步提取，无需衍生)、灵敏度高、检出范围宽、高效快速，可以在30 min内完成整个分析过程。

氨基酸；液相色谱-质谱联用；植物组织

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，它参与生物的新陈代谢和生理过程，氨基酸分析在农业、食品科学、医学研究中有广泛而重要的作用。1958 年，Spackman 等[1]首先提出用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸，实现氨基酸分析的自动化。之后，新的氨基酸分析方法不断涌现，例如柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法、毛细管电泳法、超高压液相色谱法等[2-3]。由于氨基酸不具有分光检测所需的生色基团， 用上述的色谱方法进行检测时需对氨基酸进行柱前或柱后衍生，但衍生化操作步骤繁琐，耗时耗力[4-5]， 而且对衍生化合物的稳定性难以进行直观的评判，某些氨基酸衍生反应的完全程度也难以保证。 同时衍生反应还可能生成非目标衍生物，这些都会影响氨基酸的准确测定。现在广泛使用的全自动氨基酸分析仪也同样存在氨基酸的衍生问题。另外，上述液相色谱(LC)等方法主要通过保留时间来识别化合物，必须花费较多时间摸索适当的色谱分离条件以准确判定待测物。但化合物共流出的问题致使不能区分某些待测化合物和干扰物，从而影响定性和定量的准确性。

近年来，随着电喷雾离子化(ESI) 和串联质谱(MS/MS) 技术的发展， LC-ESI-MS/MS 联用在化合物分析中得到广泛的应用[6-10]。质谱检测器具有灵敏度高、选择性强等特征，常应用于复杂痕量样品的定性定量。特别是其具有特征离子提取功能，与色谱方法相比，对待测物色谱分离的要求相对较低，即使液相没有很好分离, 通过选择离子扫描, 可以对含有多种成分的复杂样品的母离子及相应的子离子同时进行监测,从而实现对每一种成分准确定性及定量。另外，由于质谱可以直接测定物质的准分子离子及特征碎片信息，因而无需对样品进行衍生化和固相萃取等复杂的前处理，就可以直接上机测定，这大大简化分析步骤，提高分析效率。

本研究拟将离子阱液质联用仪应用于游离氨基酸的分析测试。通过对23种游离氨基酸的质谱行为、色谱行为及样品的提取方法进行系统的研究，旨在开发一种样品制备简单(一步提取，无需衍生)、灵敏度高、检出范围宽、重现性好、高效快速(30 min内完成分析)的游离氨基酸测定方法。

1　材料与方法

1.1试验材料

选用的5种作物(小麦、甘蓝、烟草、菠菜、茄子)，均种植于西北农林科技大学应用昆虫学重点实验室人工气候室(16L∶8D，白天23 ℃，晚上18 ℃)。土壤基质为草炭和珍珠岩(体积比为5∶1)，按需浇水。

液相色谱-质谱联用仪(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)，配备自动进样器、四元梯度质谱泵，LTQ 离子阱质谱带电喷雾电离源, Xcalibur 2.1 系统控制软件。Millipore纯水机，Sartorious MSA 3.6P-000-DM 电子天平(精度为0.001 mg)，岛津Shimadzu 0.22 μm尼龙针式滤头。

1.3试 剂

β-氨基丁酸(BABA，纯度>99%)、γ-氨基丁酸 (GABA，纯度>99%)、混合氨基酸标准溶液(AAS18-Amino Acid Standard，含17 种氨基酸：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、 L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、 L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸，浓度均为2.5 mmol/L) 购自美国Sigma-Aldrich 公司； L-谷氨酰胺(纯度>98.5%，AMRESCO分装)、天冬酰胺 (纯度>99%，AMRESCO分装) ; L-色氨酸(纯度>99%，AMRESCO)、L-半胱氨酸(纯度>99%，AMRESCO)，Milli-Q 级水由Millipore Element A10 制备, 若不经特别说明，试验中用水均为Milli-Q 级水。甲醇和甲酸( HPLC级，德国MERCK 公司)，EDTA、乙醇、盐酸均为国产分析纯。

1.4植物叶片中游离氨基酸提取

分别称取新鲜植物叶片500 mg，加入1 mLφ=50% 的乙醇水溶液(含0.1 mol/L 的HCl)，使用研磨棒充分匀浆，12 000 r/min 离心10 min，上清用0.22 μm针头滤器过滤后即可上机检测。其中小麦为出苗7 d麦苗，样品取第一片叶；甘蓝为生长至6片真叶的甘蓝苗，取顶部幼嫩叶片；烟草为生长至6～8片真叶的烟苗，取顶部叶片；菠菜取自具有5 片真叶的幼苗；茄子取自具有4 片真叶的顶部叶片。

1.5色谱条件

岛津公司的Intertsil OSD-4 C18色谱柱(250 mm ×3.0 mm，填料粒径5 μm )，进样方式为全环(25 μL)，流速300 μL/min，柱温箱25 ℃，样品盘温度10 ℃，洗针体积800 μL。流动相A: Milli-Q级水；流动相B:甲醇；流动相C:φ=0.5%甲酸溶液。流动相洗脱梯度见表1。

表1　23种氨基酸色谱分离的流动相梯度

1.6质谱条件

在项目水资源论证报告书审查过程中，专家组详细分析了各项目区水资源开发条件、各水源供水基础设施数量及供水能力、机电井分布及供水状况，明确要求水源确定时要优先考虑地表水，合理开发地下水，禁止开采深层承压水。地表水资源相对丰富、具备供水条件和供水能力的项目区，应进一步压缩地下水开采量；项目实施必须开采地下水资源的，要实行地下水总量与水位双控制，科学论证地下水取水规模、新建和改造井数及适宜井深；严格控制生态脆弱区取用地下水，禁止在地下水超采区新增地下水开采，确保项目实施后地下水的采补平衡。

电喷雾电离源(ESI)，阳离子模式，喷雾电压4.5 kV，离子传输毛细管温度设为275 ℃，鞘气和辅助气分别为25 L/min及8.0 L/min。采用数据依赖性扫描方法对氨基酸进行碎裂和扫描。每种氨基酸的具体测定参数如表2所示。

表2　23种氨基酸的质谱测定参数

2　结果与分析

2.123种氨基酸的色谱行为

使用岛津公司的Intertsil OSD-4 C18色谱柱，采用甲醇-甲酸体系进行洗脱，可以对23种氨基酸获得比较理想的分离效果。在此条件下,23种氨基酸在16 min内全部流出色谱柱，值得注意的是异亮氨酸(Ile)/亮氨酸(Leu)及赖氨酸(Lys)/谷氨酰胺(Gln)这2对同分异构体能达到基线分离, 23种氨基酸的色谱分离效果如图1所示。

RT.保留时间　Retention time； SM.曲线平滑参数　Smoothing parameter

2.223种氨基酸的质谱行为

分别将23氨基酸标准品直接引入质谱仪，分别研究每一种氨基酸在正、负离子模式下的裂解行为。通过调整喷雾电压、气体流速、碰撞能量等参数，选择丰度高、重现性好碎片离子用于后续定量。经过对比和优化，在阳离子模式下，23种氨基酸均有良好的灵敏度及稳定的二级质谱裂解行为，23种氨基酸准分子离子峰均为[M + H ]+峰，其质谱断裂方式也存在共性，在二级质谱碎片中易产生脱HCOOH (46)、CH3COOH(60) 或NH3(17) 的特征碎片离子，这也是氨基酸特有的中性碎片丢失。每种氨基酸对应的质谱图如图2所示。

图2　23种氨基酸的二级质谱

2.3标准曲线

将23种氨基酸标准溶液稀释成0、0.04、0.20、1.0、5.0、25.0 μmol/L 6个不同浓度，测定后以氨基酸浓度为横坐标(x)，峰面积响应值为纵坐标(y)， 绘制标准曲线。 进行线性回归分析，计算相关系数。23种氨基酸浓度和质谱响应值呈良好的线性关系，相关系数分布为0.990 6～1.000 0，如表3所示。

2.4检出限

通过实际测定系列低浓度的氨基酸标准样品，得到检出限，以信噪比(S/N) 为3 进行确定。质谱仪具有极高的灵敏度，23种氨基酸检出限从从0.20 pmol (Pro)至10.00 pmol(Gly)不等，绝大多数氨基酸的检出限为0.20～1.40 pmol，如表3所示。

表3　23种氨基酸的线性回归方程、相关系数及检出限的测定结果

2.5回收率

向提取的氨基酸样品中加入标准溶液进行回收率试验, 并进行6次平行试验计算平均回收率和精密度。23种氨基酸的回收率分布在73%～152%，大部分氨基酸的回收率为90%～110%；相对标准差(RSD)分布在1.3%～14.1%，绝大部分氨基酸的RSD保持在8%以内，如表4所示,Cyss及BABA在选取的植物样品中未检测到，所以未进行加标回收试验。

2.6方法应用

采用该方法分别对植物源材料(小麦、甘蓝、烟草、菠菜、茄子)的叶片中总游离氨基进行测定，结果如表5所示。

表4　23种氨基酸的回收率及精密度测定结果

表5　植物叶片中游离氨基酸测定结果

注：NF表示该种氨基酸低于检出限。

Note: NF means not detectable.

3　讨 论

采用传统方法进行氨基酸分析时，由于氨基酸不具有光学检测所需的生色基团，所以检测时需要对氨基酸进行耗时耗力的柱前或柱后衍生反应，以便光学检测器能够识别氨基酸，更值得注意的是，有些氨基酸衍生反应的完全程度很难保证，衍生反应有时会生成非目标衍生物，这些都会影响氨基酸的准确测定。所以进行传统的氨基酸分析时样品的制备条件比较苛刻[2-5]。相对于传统的氨基酸分析方法，该方法提取步骤简单，无需对氨基酸进行柱前或柱后衍生，直接对氨基酸分子原形进行质谱检测，因而不存在衍生反应是否完全等问题，大大简化操作步骤，降低试验误差。同时质谱仪具有超高的灵敏度，特别是其具有离子提取功能， 通过选择性离子扫描, 可以对含有多种成分的复杂样品的母离子及相应的子离子同时进行监测,从而实现对每一种成分准确定性及定量。与传统色谱方法相比，该方法对氨基酸的色谱分离的要求相对较低，即使液相没有很好分离,也可以实现对氨基酸的准确定性及定量，从而使液相分离时间大幅度降低，传统的氨基酸分析仪单个样品分析时间需1 h左右[11-12]，本研究中的方法在保证回收率及精密度的同时，整个分析过程仅需20 min，大大提高分析效率。由于质谱仪具有超高的灵敏度，该方法的灵敏度较氨基酸分析仪提高近10倍，氨基酸分析仪对氨基酸的最低检出限为3 pmol[11-15], 该方法对有些氨基酸的检出限低至0.20 pmol。

本研究中分别对来自5种不同种属的植物源材料，包括小麦、甘蓝、烟草、菠菜和茄子苗期叶片中总的游离氨基酸采用盐酸-乙醇法进行简单的一步提取，然后直接上机检测。测定结果显示，该方法通用性良好、样品制备简单(一步提取，无需衍生)、灵敏度高、检出范围宽、高效快速，可以在30 min内完成整个分析过程。方法的精密度验证表明，该方法的灵敏度及稳定性可完全满足相关试验需要。

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Corresponding authorLIU Tongxian,male,professor.Research area:agricultural insect and pest control.E-mail: txliu@nwsuaf.edu.cn

(责任编辑：成敏Responsible editor:CHENG Min)

Simultaneous Analysis of 23 Amino Acids in Different Plant Tissues by Liquid Chromatography Ion Trap Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Zhanfeng1, LI Hongxia2, FAN Yongliang1, SONG Yue1,WU Lijuan1, TIAN Honggang1, LIU Xiaofeng1and LIU Tongxian1

(1.College of Plant Protection, State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Key Laboratory of Integrated Pest Management on the Loess Plateau of Ministry of Agriculture, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China；2.College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100)

A method for simultaneous analysis of 23 free amino acids in different plant tissues was developed using liquid chromatography ion trap tandem mass spectrometry under positive ionization mode．Plant samples were extracted directly using hydrochloric acid-ethanol solution, and analyzed without derivatization or solid phase extraction. The LC separation was carried on a reversed-phase Intertsil OSD-4 C18(250 mm ×3.0 mm )with the mobile phase of methyl alcohol/formic acid /water solution in gradient mode. The results showed that the developed method is of good efficiency, sensitivity and selectivity, and has been successfully applied to determine the free amino acids in different plant tissues.

Amino acid；Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)；Plant tissue

2015-05-05Returned2015-08-07

New Function Development Project of Large Instrument of Northwest A&F University (No.dysb130103); National Key Basic Research Program of China (No.2013CB127600); the Agricultural Science and Technology Innovation and Research of Shaanxi Province (No.2015NY109).

ZHANG Zhanfeng,male,experimentalist,doctoral student.Research area:instrumental analysis and chemical ecology.E-mail: zhanfengfwjt@nwsuaf.edu.cn

2015-05-05

2015-08-07

西北农林科技大学大型仪器设备新功能开发项目(dysb130103)；国家重点基础研究发展计划(2013CB127600)；陕西省农业科技创新与攻关项目(2015NY109)。

张战凤，男，实验师，在职博士研究生，从事仪器分析及化学生态方面的研究。E-mail: zhanfengfwjt@nwsuaf.edu.cn

刘同先，男，教授，主要从事农业昆虫及害虫防治方面的研究。E-mail: txliu@nwsuaf.edu.cn

O657.6

A

1004-1389(2016)08-1229-08

网络出版日期：2016-07-14

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160714.1105.034.html