响应面法优化超声辅助提取白兰叶总黄酮工艺

陈建福,林　洵,林萍萍,庄远红

(1.漳州职业技术学院 食品与生物工程系,福建漳州 363000;2.闽南师范大学 生物科学与技术学院,福建漳州363000;3.农产品深加工及安全福建省高校应用技术工程中心,福建漳州 363000)



响应面法优化超声辅助提取白兰叶总黄酮工艺

陈建福1,2,3,林洵1,3,林萍萍2,庄远红2

(1.漳州职业技术学院 食品与生物工程系,福建漳州 363000;2.闽南师范大学 生物科学与技术学院,福建漳州363000;3.农产品深加工及安全福建省高校应用技术工程中心,福建漳州 363000)

为优化超声波辅助提取白兰叶总黄酮工艺,在单因素实验的前提下,以总黄酮得率为响应值,选择乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度4个因素为自变量,进行Box-Behnken实验设计,研究4个因素及其交互作用对白兰叶总黄酮得率的影响。研究结果表明超声波辅助提取白兰叶总黄酮的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度为54%,液料比为19 mL/g,超声时间为25 min,超声温度为66 ℃,在此条件下,测得白兰叶总黄酮的得率为9.94%,与预测值相对误差为0.30%,说明回归模型的拟合度较高,该研究为白兰叶开发成天然抗氧剂奠定了理论基础和科学依据。

白兰叶,总黄酮,超声波提取,响应面法

白兰(Micheliaalba)又名白兰花、缅桂,属木兰科,含笑属常绿乔木,在我国各地均有栽种,尤其是东南地区和西部,是名贵的观赏香味型园林植物[1-2]。白兰花和叶中具有挥发性的芳香精油,不仅能供人观赏,还具有诸多药理功能的黄酮、多糖等生物活性成分[3-4]。黄酮类物质是植物体内重要的天然化合物,具有明显的抗炎、清除自由基、抑制细菌、抗瘤、抗衰老、增强免疫力等作用[5-6]。随着生活水平的提高,人们越来越崇尚回归自然,一些富含黄酮等天然有效成分的产品日益受到人们的追捧,然而目前尚未有对白兰叶总黄酮提取的相关报道。另外随着科技的发展,超声波辅助技术在植物提取方面的优势越来越显著[7],利用超声波产生的高加速度、猛烈振动、剧烈的空化作用、热效应以及搅拌作用等能够使植物有效成分更易进入溶剂,具有省时、节能、高效和操作简单的特点。本研究以白兰叶为原料,通过超声技术对白兰叶总黄酮进行提取,在单因素的前提下运用响应面法,以总黄酮得率为指标对提取工艺进行优化,为白兰叶黄酮资源的深入研究以及白兰叶抗氧化剂的开发利用提供参考和指导。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

白兰叶采摘于漳州市胜利西路;芦丁标准品>98%上海沪宇生物试剂公司;95%乙醇,食品医药级河南浩宇食品添加剂有限公司;氢氧化钠、亚硝酸钠和硝酸铝等均是分析纯。

Q-250B高速多功能粉碎机上海冰都电器有限公司;KQ-100DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;UV-1100型紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司;AR124CN电子天平奥豪斯仪器上海有限公司。

1.2实验方法

1.2.1总黄酮含量的测定以芦丁为标准品,按文献[8]方法,采用NaNO2-Al(NO3)3比色法,绘制标准曲线,得回归方程。准确量取一定量的提取液于10 mL容量瓶中,按照文献方法进行测试,代入回归方程计算出总黄酮浓度,通过式(1)换算成总黄酮的得率。

式(1)

其中:m为白兰叶粉末的质量(g);b为总黄酮质量浓度(mg/L);V为提取液体积(L)。

1.2.2单因素实验设计将采摘的白兰叶用清水浸泡洗净,取出晾干,放进烘箱干燥,粉碎后备用。精确称取1.0 g原料于100 mL圆底烧瓶中,在设定好温度、时间的超声波清洗器中回流浸提,提取结束后,冷却过滤,稀释,定容,按1.2.1中的方法算出白兰叶总黄酮的得率。

1.2.2.1乙醇浓度对总黄酮得率的影响固定料液比为30 mL/g,超声时间45 min,超声温度60 ℃的条件下,研究不同乙醇浓度(45%、55%、65%、75%、85%)对白兰叶总黄酮得率的影响。

1.2.2.2液料比对总黄酮得率的影响固定乙醇浓度为55%,超声时间45 min,超声温度60 ℃的条件下,考察不同液料比(10、20、30、40、50 mL/g)对白兰叶总黄酮得率的影响。

1.2.2.3超声时间对总黄酮得率的影响固定乙醇浓度为55%,液料比为20 mL/g,超声温度为60 ℃的条件下,研究不同超声时间(15、25、35、45、55 min)对白兰叶总黄酮得率的影响。

1.2.2.4超声温度对总黄酮得率的影响在乙醇浓度为55%,液料比为20 mL/g,超声时间25 min的条件下,研究不同超声温度(50、55、60、65、70 ℃)对白兰叶总黄酮得率的影响。

1.2.3响应面实验设计在单因素的基础上,用Box-Behnken对表1中ABCD四个变化因素,进行四因素三水平响应面实验,4个自变量因素编码及水平见表1。最后利用响应面软件对数据进行处理,以获得最佳提取条件。

表1　Box-Behnken分析因素水平表Table 1　Factors and levels of Box-Behnken

1.2.4数据统计分析实验数据采用“平均值±标准差”,n=3。实验数据采用Design Expert 8.05b、Origin7.5和Excel 2003进行处理。

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1乙醇浓度对白兰叶总黄酮得率的影响由图1可得,乙醇浓度增加,总黄酮得率跟着增加,当乙醇浓度达到55%时,得率出现峰值,随着乙醇浓度的继续增加,得率反而降低。这是因为太高的乙醇浓度,导致更多的脂溶性杂质(鞣质、色素等)溶出而使得水溶性黄酮的溶出减少,从而降低了黄酮的得率[9]。因此最佳乙醇浓度为55%。

图1　乙醇浓度对总黄酮得率的影响Fig.1　Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

图2　液料比对总黄酮得率的影响Fig.2　Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

2.1.2液料比对白兰叶总黄酮得率的影响由图2可得,液料比从10 mL/g增大到20 mL/g,总黄酮得率急剧上升,在液料比为20 mL/g时,对总黄酮得率的影响最明显,随着液料比的增加,总黄酮得率呈现下降的趋势。这是因为液料比越大,体系间的浓度差就越大,促进总黄酮的充分浸出,使得得率提高。但是过大的液料比,使超声波能量更容易被溶剂吸收,空化泡对能量的吸收则相应减少,导致细胞壁不完全破裂,目标提取物不能充分溶出细胞[10],从而大大降低了总黄酮得率。同时溶剂过多不仅会影响体系间的传热和传质,还会造成能源的浪费,因此从节约能源考虑,液料比应选择20 mL/g。

2.1.3超声时间对白兰叶总黄酮得率的影响由图3可得,白兰叶总黄酮得率随着超声时间的延长而迅速提升,在超声25 min时达到峰值,继续增加超声时间,得率不但没有升高还呈下降趋势。这是因为超声时间过长时,长时间的超声作用使得已溶出的黄酮类化合物降解以及溶剂挥发导致乙醇浓度降低,最后造成黄酮得率不断下降。因此最佳超声时间为25 min。

图3　超声时间对总黄酮得率的影响Fig.3　Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoids

2.1.4超声温度对白兰叶总黄酮得率的影响由图4可得,超声温度在50～65 ℃之间,总黄酮得率不断上升,这是因为温度升高加快了分子的平均动能,提高了总黄酮的溶出,从而提高了得率。但是继续升高温度,得率却呈直线下降,这是因为总黄酮容易在过高的温度下发生氧化或降解,从而降低了总黄酮的得率[11]。因此最佳的温度应为65 ℃。

图4　超声温度对总黄酮得率的影响Fig.4　Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of total flavonoids

2.2响应面法优化结果及分析

2.2.1数学模型及方差分析根据单因素结果和Box-Behnken中心组合实验设计原理,采用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行回归设计,利用Box-Behnken实验的4因素3水平组成29个实验点(白兰叶总黄酮得率见表2),包含24个析因实验,5个中心点实验。自变量取值在乙醇浓度(A)、液料比(B)、超声时间(C)、超声温度(D)所构成的三维顶点,后5个是区域的中心点,用来估计实验误差。

表2　响应面分析方案及结果Table 2　Experiment design and result of response surface method analysis

经软件对表2的实验数据进行分析后,得到白兰叶总黄酮得率(Y)的回归模型为:Y=9.93-0.31A-0.14B+0.10C+0.22D-0.12AB+0.17AC+0.0075AD+0.13BC+0.19BD-0.098CD-2.03A2-0.40B2-0.44C2-0.38D2

并对该回归方程进行显著性检验。由统计学相关知识对表3进行分析,可得p<0.0001,该数据说明模型达到极显著水平,方程的回归系数R2=0.9929,说明模型的拟合度好,该模型可以解释超过99%的数据;失拟度p=0.1076>0.05,不显著,表明回归方程与实验值拟合较好,实验误差小;根据F值大小可以得出各关键因素对得率的影响力度为:乙醇浓度>超声温度>液料比>超声时间。其中A、B、D、BD、A2、B2、C2和D2对结果影响极其明显(p<0.01),C、AC对结果影响显著(p<0.05),说明所考察的四个工艺条件与总黄酮得率之间不是简单的线性关系。综上所述,该模型可以分析和预测白兰叶总黄酮得率,并确定最佳提取工艺条件。

表3　回归模型方差分析Table 3　Analysis of variance for the regression equation

注:*p<0.05,差异显著;**p<0.01,差异极显著。

2.2.2响应面分析响应面和相应的等高线图可以直观地看出各因素极其交互作用对白兰叶总黄酮得率的影响,每个响应面控制两个因素不变,分析另外两个因素对响应值的影响。等高线的形状也可反映出交互效应的强弱,趋向椭圆且椭圆的轴线与坐标轴存在一个角度,表明交互作用明显;反之,则交互作用较低。将所有等高线图经等高线性质分析,可得乙醇浓度与超声时间、液料比与超声温度存在明显的交互作用,其余因素交互作用则不显著。交互作用最显著的响应面图,如图5所示。

图5　液料比和超声温度对总黄酮得率的影响Fig.5　Effect of liquid-material ratio and ultrasonic temperature on yield of total flavonoids

从图5可得:液料比(B)和超声温度(D)的等高线呈上升现象,在液料比较小时,等高线比较平坦,说明白兰叶总黄酮得率受液料比的影响不明显,而当液料比(B)较高水平时,等高线排列相对紧凑,表明液料比对总黄酮得率的影响相对比较明显;而且等高线图形趋向椭圆,说明2个因素间的交互作用显著。

2.2.3最佳工艺条件的确定通过Design Expert 8.0.6软件,对回归模型进行预测得到超声辅助提取白兰叶总黄酮的最佳工艺条件为:乙醇浓度为54.29%,液料比为19.10 mL/g,超声时间为25.61 min,提取温度为66.26 ℃;在该工艺条件下,白兰叶总黄酮得率理论值可达9.97%,考虑到实际操作条件,将工艺条件修正为乙醇浓度为54%,液料比为19 mL/g,超声时间为25 min,提取温度为66 ℃进行验证实验,实际测得白兰叶总黄酮的得率为9.94%,其相对误差为0.30%,说明回归模型的拟合度较高,可利用响应面法对白兰叶总黄酮提取工艺进行优化。

3　结论

在单因素实验的前提下,选择乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度作为自变量进行Box-Behnken中心组合实验设计,并应用软件进行数据拟合,建立了超声提取白兰叶总黄酮的数学回归模型。模型分析表明,这个模型具有较高的稳定性。并根据模型的回归方程及其等高线图,对各关键因素及其相互作用进行研究,得到因素的主效应顺序为:乙醇浓度>超声温度>液料比>超声时间。液料比与超声温度之间存在明显的交互作用。超声辅助提取白兰叶总黄酮的最佳工艺条件为:乙醇浓度为54%,液料比为19 mL/g,超声时间为25 min,提取温度为66 ℃,在该条件下,测得白兰叶总黄酮得率为9.94%,与预测值其相对误差为0.30%,说明回归模型的拟合度较高,可用于优化白兰叶总黄酮提取工艺,该研究为白兰叶开发成天然抗氧化剂品奠定了理论基础和科学依据。

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Ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids fromMicheliaAlbaleaves using response surface methodology

CHEN Jian-fu1,2,3,LIN Xun1,3,LIN Ping-ping2,ZHUANG Yuan-hong2

(1.Department of Food and Biology Engineering,Zhangzhou Institute of Technology,Zhangzhou 363000,China;2.College of Biological Science and Technology,Minnan Normal University,Zhangzhou 363000,China;3. Applied Technology Engineering Center of Fujian University for Further Processing and Safety of Agricultural Products,Zhangzhou 363000,China)

The ultrasonic-assisted extraction conditions of polyphenol frommicheliaalbaleaves were optimized by response surface methodology. Based on single factor test,a 4-factor,3-level Box-Behnken experimental was adopted including dependent variables(ethanol concentration,liquid to material ratio,ultrasonic time and ultrasonic temperature)and independent variable(yield of polyphenols). The results showed that the optimum conditions were ethanol concentration 54%,liquid to material ratio 19 mL/g,ultrasonic time 25 min,ultrasonic temperature 66 ℃. The yield of total flavonoids could be up to 9.94% under the optimal extraction condition,the relative error was 0.30% compared to the predictive value,which indicated the feasible model fitted well with the experimental data. The research could be developed a theoretical foundation and a scientific basis for the extraction of total flavonoids frommicheliaalbaleaves into natural antioxidant.

MicheliaLeaves;total flavonoids;ultrasonic-assisted;response surface methodology

2016-01-14

陈建福(1982-)，男，博士，讲师，研究方向：天然产物化学工艺，E-mail：qjf1996@163.com。

福建省高校杰出青年科研人才培育计划(闽教科[2015]54号)；福建省中青年教师教育科研项目计划(JA15688)；漳州职业技术学院科技计划项目(ZZY1502)。

TS201

B

1002-0306(2016)15-0238-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.038