益生菌发酵胡萝卜汁中不同方法制备的水溶性多糖理化特性

徐萌萌,殷军艺,万宇俊,聂少平,谢明勇

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)



益生菌发酵胡萝卜汁中不同方法制备的水溶性多糖理化特性

徐萌萌,殷军艺,万宇俊,聂少平,谢明勇*

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

本文主要研究益生菌发酵胡萝卜汁中水溶性多糖的理化特性,采用热水浸提和直接离心取上清两种方法从发酵胡萝卜汁中制备多糖(分别记为WEP,CEP),比较两者在中性糖含量、蛋白质含量、糖醛酸含量、相对分子质量、红外光谱、固体形貌等方面的差异性。结果显示,WEP和CEP的基本理化性质较为相似,但两者的中性糖含量、蛋白含量还是存在一定差异性。通过高效凝胶渗透色谱法测得WEP和CEP的相对分子质量和分布较为接近。WEP和CEP的红外光谱均具有典型的多糖吸收峰,同时两者均具有表面光滑的片状形貌。上述结果表明,采用热水浸提和直接离心取上清制备得到的益生菌发酵胡萝卜水溶性多糖,结构特征差异较小,这为今后益生菌发酵胡萝卜汁中多糖的结构和益生功能的深入研究提供参考。

益生菌发酵胡萝卜汁,水溶性多糖,理化特性

随着消费者生活水平、消费观念及消费质量的不断提高,低热量、低脂肪、低蛋白质但富含膳食纤维的果蔬饮料越来越受到人们的青睐[1]。果蔬饮料中含有的多种维生素、矿物质和膳食纤维,可以补充人们膳食中容易缺乏的营养物质,并具有抗氧化、降低患冠心病、癌症和许多慢性疾病的风险等功效[2-4]。

胡萝卜富含功能性成分如维生素和矿物质,尤其含有大量的胡萝卜素,具有很高的营养价值[5]。现代研究表明,胡萝卜的保健功能有:提高机体的防癌抗癌能力[6];抗氧化,延缓衰老的功效[7];提高机体抵抗疾病的能力,并对 VA进行安全补充的功能[8]。多糖作为维持生命活动正常运转的四大基本物质之一[9],在生命活动中扮演着重要角色,有研究已证实某些多糖具有良好的生物活性功能,如免疫调节[10]、抗肿瘤[11]、降血糖功能[12]等。胡萝卜中的多糖也具有一定的功能活性,阚郭仕[13]等报道胡萝卜多糖能显著降低小鼠血清中谷丙转氨酶、甘油三酯及丙二醛的含量,并促使超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性显著增强,对酒精肝损伤有一定预防作用。刘立新[14]等通过实验证实胡萝卜多糖较强的清除·OH和抗自氧化作用以及能显著性抑制二甲苯的致炎作用。

本课题组前期研究发现益生菌发酵胡萝卜汁及其多糖具有较好的功能活性[15],但该果汁中多糖的结构特征还不明确。因此,本研究以益生菌发酵胡萝卜汁为原料,利用不同方式制备得到发酵胡萝卜汁中的水溶性多糖,通过比较两者在基本理化性质、相对分子质量、红外吸收光谱以及固体形态方面的差异,试图阐述发酵胡萝卜汁中的水溶性多糖基本结构特征,以及不同制备方法所得水溶性多糖结构特征差异性,以期为后期益生菌发酵胡萝卜汁中多糖的结构与功能研究提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

益生菌发酵胡萝卜汁购自南昌旷达生物科技有限公司。

半乳糖、半乳糖醛酸美国Sigma公司;Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、蓝色葡聚糖标准品(纯度≥99.4%)美国Pharmacia公司;透析袋(截留分子量3500)上海国药集团化学试剂有限公司;考马斯亮蓝G-250(进口分装)德国Fluk公司;牛血清蛋白(生化试剂)美国Amersco公司;无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、叠氮钠、浓硫酸等均为国产分析纯。

Milli-Q超纯水仪美国Millipore公司;ALPHA 1-2 LD冷冻干燥机德国 Martin Christ公司;TU-1900双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;Agilent 1260高效液相色谱美国安捷伦公司;Nicolet 5700傅里叶红外光谱仪美国Thermo公司;ANKE TDL-5-A离心机上海安亭分析仪器有限责任公司;N-1100型旋转蒸发仪上海爱朗仪器有限公司,等。

1.2益生菌发酵胡萝卜汁中水溶性多糖的制备

水提多糖的制备:取发酵胡萝卜汁适量,热水浴(90 ℃)加热2 h,4800 r/min离心10 min,收集上清液并通过真空浓缩至原体积的1/8,加入95%乙醇沉淀(终浓度为80%),收集多糖沉淀。多糖沉淀加水复溶,再用Sevag法[16](氯仿-正丁醇体积比为4∶1)脱蛋白(多糖与Sevag试剂比为3∶1),反复脱除至无明显蛋白层,离心收集多糖溶液,并将多糖溶液进行透析、冻干,得到多糖制品,记为WEP(Water Extracted Polysaccharide)。

上清液多糖的制备:取发酵胡萝卜汁适量,4800 r/min离心10 min,收集上清液并通过真空浓缩至原体积的1/8,加入95%乙醇沉淀(终浓度为80%),收集多糖沉淀。多糖沉淀加水复溶,再用Sevag法[16](氯仿-正丁醇体积比为4∶1)脱蛋白(多糖与Sevag试剂比为3∶1),反复脱除至无明显蛋白层,离心收集多糖溶液,并将多糖溶液进行透析、冻干,得到多糖制品,记为CEP(Centrifugate Extracted Polysaccharide)。

多糖得率计算公式如下:

1.3基本理化性质测定

以半乳糖为标准,苯酚-硫酸法测定中性糖含量[17],测定波长为490 nm。

以牛血清蛋白为标准,考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[18],测定波长为595 nm。

以半乳糖醛酸为标准,间羟基联苯比色法测定糖醛酸含量[19],测定波长为530 nm。

上述中性糖、蛋白质和糖醛酸含量测定,计算公式为:样品测定浓度/样品实际浓度×100%。

1.4纯度及相对分子质量分析

将葡萄糖、Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、蓝色葡聚糖标准品分别配制成质量浓度均为2 mg/mL的溶液,并过0.22 μm滤膜制得一系列标准品,然后用 HPLC(Agilent 1260)进行分析[20-21]。益生菌发酵胡萝卜汁的多糖样品用超纯水配成2 mg/mL 的溶液,过0.22 μm的滤膜同上述标准品一起按如下色谱条件检测[22],色谱柱:UltrahydrogelTMLinear Column(7.8 mm×300 mm,10 μm),柱温35 ℃;流动相为0.02% NaN3溶液,流速0.6 mL/min;检测器为G1362A示差检测器,检测器温度35 ℃;进样量:10 μL;ChemStation色谱工作站采集分析数据。根据标准品相对分子质量和保留时间的线性关系,绘制标准曲线,再利用多糖样品的保留时间计算得到平均相对分子质量。

1.5红外光谱扫描分析

采用Thermo Nicolet 5700红外光谱仪对发酵胡萝卜汁多糖进行红外光谱扫描,KBr压片,测定波数为4000～400 cm-1[23]。

1.6扫描电镜

多糖经过冷冻干燥处理,通过喷金将样品固定在样品台上,最后置于SEM中观察,加速电压为5.0 kV。

1.7数据处理

实验数据利用SPSS 20.0软件,采用单因素方差分析进行显著性差异比较(p<0.05)。

2　结果与分析

2.1基本理化性质分析

经过脱蛋白、透析、冻干等步骤得到两种精多糖,通过比色法对WEP、CEP的中性糖含量和蛋白含量、糖醛酸含量进行了测定(表1)。WEP和CEP的得率分别为0.11%和0.10%,WEP、CEP两者糖醛酸含量较为接近,但中性糖含量和蛋白含量差异显著(p<0.05)。

表1　益生菌发酵胡萝卜汁中水溶性多糖得率 和基本理化性质分析(x±s,n=3)Table 1　Yield and basic physical-chemical properties of water-soluble polysaccharide from carrot juice fermented by probiotics(x±s,n=3)

注:同一列字母不同表示差异显著(p<0.05)。

2.2多糖纯度及相对分子量

图1为WEP与CEP的高效凝胶渗透色谱图,图中多糖分子质量分布相对集中,由葡聚糖标准品在高效凝渗透色谱图上保留时间和分子量关系建立的标准曲线,可推导、计算得到两种多糖色谱图(峰1、峰2和峰3)上对应色谱峰的相对分子质量,WEP的3个主峰平均相对分子质量依次为1.10×106、2.95×105、3.02×103,峰面积相对含量依次为13.9%、75.9%、4.7%;CEP的3个主峰平均相对分子质量依次为1.32×106、3.24×105、3.02×103,峰面积相对含量依次为17.6%、74.1%、4.1%。

图1　益生菌发酵胡萝卜汁中水溶性多糖高效凝胶色谱图Fig.1　HPGPC spectrum of water-soluble polysaccharide from carrot juice fermented by probiotics

2.3红外光谱特征

图2　益生菌发酵胡萝卜汁中水溶性多糖红外光谱图Fig.2　Infrared spectrum of water-soluble polysaccharide from carrot juice fermented by probiotics

从两种多糖的IR图谱(图2)可以得出以下结构特征:在3432 cm-1附件处宽而强的吸收峰应该为糖类O-H的伸缩振动。在3000～2800 cm-1之间出现的弱吸收峰应该是甲基或亚甲基C-H的伸缩振动,为糖类的特征吸收峰,2938 cm-1附件的吸收峰为糖类C-H伸缩吸收峰。1741 cm-1处的吸收峰表明多糖中含有-COO基团,1622 cm-1是伯胺N-H键的弯曲振动吸收峰。1437 cm-1应该为N-H的变角振动。1160～950 cm-1范围内的强吸收带则被认为是吡喃环的伸缩振动[24]。因此WEP和CEP的红外光谱特征较为相似。

2.4SEM结果分析

SEM是表征多糖表观形貌的常用手段,本研究采用SEM分析两种提取方法多糖的表观形貌的差异,结果如图3:冻干后WEP与CEP的SEM图,显示二者均为片状体,差异较小。

图3　益生菌发酵胡萝卜汁中WEP和CEP的SEM图谱Fig.3　The SEM images of polysaccharides extracted from carrot juice fermented by probiotics注:A1和A2分别为WEP在不同倍数下的SEM图谱, B1和B2分别为CEP在不同倍数下的SEM图谱。

3　结论

本文以益生菌发酵胡萝卜汁为研究对象,研究了其水溶性多糖基本结构特征,结果显示益生菌发酵胡萝卜汁中水溶性多糖中含有较高的糖醛酸,主要组分的平均相对分子质量大约为300000,SEM图谱显示其具有片状固体形貌。无论是通过直接离心取上清制备水溶性多糖,还是通过热水浸提获取多糖组分,两种方法制备所得多糖的得率和基本理化性质差异比较小。上述结果将对以后的益生菌发酵胡萝卜中多糖精细结构和功能特性(如免疫调节、肠道微生态改善等)机理研究提供参考。

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Physicochemical property of different water-soluble polysaccharide from carrot juice fermented by probiotics

XU Meng-meng,YIN Jun-yi,WAN Yu-jun,NIE Shao-ping,XIE Ming-yong*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

To explore physicochemical property of water-soluble polysaccharide from the carrot juice fermented by probiotics. The polysaccharide was extracted by two different ways including hot water extraction or centrifugate extraction. The obtained fractions were named as water extracted polysaccharide(WEP)and centrifugate extracted polysaccharide(CEP),respectively. Structural characteristics differences between WEP and CEP among neutral sugar content,protein content,uronic acid content,relative molecular weight,infrared spectrum and morphology appearance were highlighted. The results showed that basic physical-chemical properties between the two fractions were similar. However,the differences of neutral sugar and protein contents between WEP and CEP were significant. HPGPC showed that the relative molecular weight and its distribution of WEP and CEP were similar. The typical polysaccharide absorption peak was both found in IR spectra of WEP and CEP. Scanning electron microscopy showed that the WEP and CEP was lamellar with smooth surface. In conclusion,there was little difference in the structural characteristics,between the water soluble polysaccharide produced by water extraction and centrifugation directly. The research would guide further study on structure and function of polysaccharides of carrot juice fermented by probiotics.

carrot juice fermented by probiotics;water soluble polysaccharide;physicochemical property

2016-03-01

徐萌萌(1989-)，女，硕士研究生，研究方向:食品科学与工程,E-mail：m18702528287@163.com。

谢明勇(1957-)，男，博士，教授，研究方向：食品化学，食品营养与安全,E-mail:myxie@ncu.edu.cn。

国家自然科学基金(31571826)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)15-0125-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.016