HPLC-MS测定多不饱和脂肪酸微胶囊粉剂中的壬基酚

李翔宇,柴莎莎,向　丽,舒　敏,肖　敏,董长春,杜明立,汪志明

(嘉必优生物工程(武汉)有限公司 湖北省营养化学品生物合成工程技术研究中心,湖北武汉 430223)



HPLC-MS测定多不饱和脂肪酸微胶囊粉剂中的壬基酚

李翔宇,柴莎莎,向丽,舒敏,肖敏,董长春,杜明立,汪志明*

(嘉必优生物工程(武汉)有限公司 湖北省营养化学品生物合成工程技术研究中心,湖北武汉 430223)

建立了多不饱和脂肪酸微胶囊粉剂中壬基酚的液相色谱-电喷雾质谱(LC-ESI-MS/MS)检测方法。样品经环己烷∶乙酸乙酯(1∶1,v/v)提取,低温冷冻离心净化,液相色谱-电喷雾质谱测定,内标法定量。通过正交实验优化了样品提取条件,最佳提取条件为提取次数为1次、超声15 min、称样质量为1.5 g,涡旋时间20 s。检出限为0.3 μg/kg,线性范围1～150 ng/mL(r=0.9998),样品测定结果为36.21～123.98 μg/kg,样品回收率为94.6%～108.1%,RSD=3.9%～14.3%(n=6)。该法简便快捷、结果准确,可用于多不饱和脂肪酸微胶囊粉剂中壬基酚的分析测定。

壬基酚,液相色谱-电喷雾质谱,多不饱和脂肪酸微胶囊粉剂

壬基酚(Nonylphenol,NP)是一种内分泌干扰物,其对人体癌细胞增长及生殖能力均会产生严重的影响,壬基酚一旦进入生物体内之后,就会影响生物体正常的生殖和发育[1-2]。

壬基酚是重要的化工原料,作为增塑剂和表面活性剂原料等被广泛用于各种产品[3-4],可通过多种途径污染食品,其亲脂性较强,易在高脂肪、高蛋白的动物性食品中富集[5-6]。

多不饱和脂肪酸主要包含二十二碳六烯酸(DHA,Docosahexaenoic Acid)及二十碳四烯酸(ARA,Arachidonic Acid)两种,是婴幼儿奶粉中不可或缺的营养物质。DHA、ARA在视网膜和大脑皮质中含量丰富,对视网膜和大脑功能具有重要的作用[7],特别是对婴儿的视力和大脑发育非常重要[8-9]。NP广泛存在于肉、蛋和奶等基质中,其中奶粉和液奶的污染较为严重,作为奶粉的重要配料,多不饱和脂肪酸微胶囊粉剂的质量控制备受奶粉制造企业的关注[10]。本文通过一系列实验对样品前处理进行了优化研究,采用液相色谱-串联质谱法,能快速准确的测定多不饱和脂肪酸微胶囊粉剂中的壬基酚,为壬基酚污染监控打下重要基础。

1　材料和方法

1.1材料与仪器

甲醇、乙酸乙酯、环己烷,为LC-MS级美国Fisher公司;4-NP标准品(纯度100%),同位素内标4-n-NP-d4(纯度98.9%)加拿大CDN isotopes公司;色谱柱安捷伦poroshell 120 EC-C18柱(50 mm×4.6 mm,2.7 μm);不同批次的多不饱和脂肪酸微胶囊粉剂(DHA含量在39%～40%左右)嘉必优生物工程(武汉)有限公司提供。实验用水Milli-Q 超纯水.

Agilent1260高效液相色谱仪美国Agilent公司,QTRAP4500质谱仪美国Sciex公司,冷冻离心机美国sigma公司,氮吹仪上海安谱科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1标准溶液的配制准确称取20 mg标准品,用甲醇定容至100 mL,配成标准储备溶液,置于-20 ℃下保存。吸取1 mL壬基酚标准储备液,用甲醇定容至100 mL,作为标准中间液。使用时将标准中间溶液稀释为合适浓度。

1.2.2样品提取称取微胶囊粉剂产品1.0 g(精确到0.0001 g)于15 mL玻璃离心管中,加入10 mL乙酸乙酯∶环己烷混合溶液(1∶1,v/v)[11],加入4-n-NP-d4内标100 μL,涡旋20 s,超声提取15 min,6000 r/min离心15 min,取上清液5 mL于氮吹管中,60 ℃水浴氮吹干,定容至2 mL,-10 ℃冷冻离心12000 r/min离心15 min后取上清于进样瓶中供液质分析。根据之前预实验的单因素结果发现称取样品的质量、提取次数、涡旋时间和超声时间对提取结果的影响最大,并由此确定了因素水平。正交实验因素及水平表见表1。选取超声时间、提取次数、涡旋时间和称取质量,以回收率为目标值,进行正交实验,确定样品提取的最佳条件。

表1　正交实验因素及水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test

实验中所用的均为玻璃器皿,使用前在马弗炉中400 ℃烘烤4 h[12],液相色谱串联质谱仪的管线均为不锈钢或聚四氟乙烯材质。标准品和实际样品测试需要做试剂空白。

1.2.3液相色谱流动相:甲醇-纯水梯度洗脱,梯度条件表见表1,流动相A为纯水,流动相B为甲醇;进样量:5 μL;流速:0.6 mL/min,柱温:(40±1)℃。

表2　色谱分离梯度条件Table 2　The chromatography separation conditions

1.2.4质谱条件采用电喷雾离子源正离子扫描;离子化电压,3500 V;加热温度600 ℃;喷雾气,55 psi;辅助加热气,55 psi。采用多反应监测具体的离子采集参数见表3。

表3　多反应监测具体的离子采集参数Table 3　The parameter of Multiselected reaction monitoring

2　结果与讨论

2.1样品提取条件优化

多不饱和脂肪酸微胶囊粉剂为基质复杂的样品,其中包括蛋白、油脂、乳糖等。若提取的不彻底,将对检测结果有较大的影响。乙酸乙酯-环己烷体系能够有效的沉淀蛋白,溶解壬基酚。选取影响提取结果的四个主要因素超声时间、提取次数、涡旋时间和称取质量,以回收率为目标值,进行正交实验,通过正交实验确定样品提取的最佳条件。实验因素水平、正交实验设计及结果分析见表4。由表4可知:各因素主次顺序为:C(称样质量/g)>A(提取次数/次)>B(超声时间/s)>D(涡旋时间/s),最佳条件为A1B2C3D2即提取次数为1次、超声15 min、称样质量为1.5 g,涡旋时间20 s。经实验验证,此最佳条件下回收率达到98.6%,并且重现性较好,三个平行样间的RSD为8%。

表4　正交实验设计及结果分析Table 4　The orthogonal experiment design and result analysis

2.2样品的净化条件

由于壬基酚在环境中普遍存在,塑料器皿或者橡胶制品等都可能迁移出大量的壬基酚,这些对分析结果将会造成较大的干扰[13]。通过实验用一次性注射器吸取少量的甲醇溶液通过0.22 μm有机系滤膜和不过膜直接进样对比发现,接触注射器和滤膜后明显有壬基酚溶出,因此不能直接过膜。不饱和脂肪酸微胶囊粉剂中含有部分油脂,经样品提取后未能完全与壬基酚分开,因此净化时还需要去除油脂。经实验发现固相萃取小柱也会发生壬基酚溶出现象,因此也不能选择固相萃取作为净化方式。

考虑到上述影响因素,参考其他资料发现[14],低温冷冻可以很好地去除油脂。因此可以使用低温冷冻高转速离心,离心后观察到有明显的油脂析出,经实验确定了最佳离心条件,低温-10 ℃,12000 r/min离心15 min取上清,这样不过膜也可以有效地去除油脂及其他杂质。使用纯甲醇进样和经低温冷冻后的纯甲醇进样,发现壬基酚并没有明显增加,具体结果见图1。

图1　样品MRM色谱图Fig.1　Chromatograms of samples under MRM mode

图1中A为纯甲醇的色谱图,B为经低温冷冻离心后的纯甲醇的色谱图,由图1可以看出,冷冻离心过程几乎不会引入壬基酚,不会对样品结果造成影响。这种方式快捷简便的实现了对样品的净化。

2.3色谱及质谱条件

比较了甲醇-水和乙腈-水两种流动相体系,发现甲醇-水为流动相时壬基酚和内标物质的响应值较高,是乙腈-水为流动相的3～6倍,故选用甲醇-水为流动相。选择ESI负离子模式下进行一级质谱扫描,得到壬基酚的分子离子峰m/z 219.1,以m/z 219.1作二级质谱,并优化质谱条件,具体见 1.2.4。以丰度较高133.0的作为定量离子,丰度较低146.9的作为定性离子并采用多反应监测(MRM)模式进行定性定量计算。图1为壬基酚及内标的MRM色谱图,保留时间为4.22 min的为目标物壬基酚的峰,保留时间为4.40 min为内标的峰。

图2　壬基酚及内标的MRM色谱图Fig.2　Chromatograms of NP and internal standard under MRM mode

2.4线性范围和定量限

配制质量浓度为0.5～200 ng/mL的系列标准工作液,内标浓度均为20 ng/mL。以目标组分峰面积与相应内标峰面积的比值X对相应浓度Y(ng/mL)进行线性回归,线性回归方程为y=0.5866x-0.0374,线性范围为1～150 ng/mL,在线性范围内相关系数(r)为0.9998。以加标样品中待测化合物色谱峰的信噪比等于3(S/N=3)对应的浓度为方法的检出限(LOD),S/N=10对应的浓度为方法的定量限(LOD),最终确定样品中LOD为0.3 μg/kg,LOQ为1.0 μg/kg。

2.5重复性

取三个不同批次配方不同的微胶囊粉剂样品,每个样品设六个平行,分别测定并计算样品的壬基酚含量和相对标准偏差(RSD),结果见表5,说明方法的重复性良好。

表5　重复性结果Table 5　Results of repeatability

2.6稳定性

取微胶囊粉剂样品,经过提取和净化后得到待检测样品溶液,分别放置0、2、4、8、12 h后,上机进样,连续进6次,样品测试结果的RSD为11.45%,表明样品在12 h内稳定。

2.7回收率和精密度

取三个不同批次的样品(配方不同),在基质中添加不同量的标准溶液,加标水平分别为5,50,100 μg/kg,每个水平设6个平行,计算三个样品的回收率和RSD,结果见表6。表6为回收率测定结果,其三个加标水平测定结果在94.6%～108.1%之间。

表6　回收率测定结果Table 6　Determination results of recovery

3　结论

采用HPLC-MS/MS的检测技术,建立了微胶囊粉剂中的壬基酚检测方法。该方法简便、快速,具有较高的灵敏度和准确度。该方法的建立为多不饱和脂肪酸微胶囊粉剂中的壬基酚监控打下坚实基础。

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Determination of Nonylphenol in polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder by liquid chromatography tandem mass spectrometry

LI Xiang-yu,CHAI Sha-sha,XIANG Li,SHU Min,XIAO Min,DONG Chang-chun,DU Ming-li,WANG Zhi-ming*

(CABIO Bioengineering(Wuhan)Co.,Ltd Hubei Province Nutrition Chemicals Biosynthetic Engineering Technology Research Center,Wuhan 430223,China)

A sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry method(LC-MS/MS)was developed for the determination of Nonylphenol(NP)in polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder.The Nonylphenol in samples was extracted with the mixture of cyclohexane and ethyl acetate(1∶1,v/v).The extractions were purified by centrifuge with low temperature and LC-MS/MS analysis was performed by positive ion electrospray ionization applying multiple reaction monitoring with internal standard method for quantitative analysis.The condition of the sample extraction was optimized by the orthogonal experiment.The optimized fermentation conditions were found to be:extraction 1 time,ultrasonic time 15 min,1.5 g samples and vortex time 20 s.The limits of quantitation(LOQ)was 0.3 μg/kg,and the method showed good linearity between 1～150 ng/mL(r=0.9998).The results of the samples were 36.21～123.98 μg/kg.The recoveries were between 94.6% to 108.1% and RSD were between 3.9% to 14.3%.The method was simple,quick and accurate.The method was proved to be appliable in the determination of NP in polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder.

Nonylphenol;HPLC-ESI-MS;polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder

2015-11-05

李翔宇(1979-),男,硕士,高级工程师,研究方向:营养化学品,E-mail:xiangyu_lee@cabio.cn。

汪志明(1969-),男,本科,高级工程师,研究方向:生物化工、脂质研究、营养化工,E-mail:jimmy_wang@cabio.cn。

国家高技术研究发展计划(863计划)项目资助(2014AA021701)、(2014AA021703)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)09-0323-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.054